ВЫДЕЛЕНИЕ ЭРИТРОЦИТАРНЫХ МЕМБРАН

Удобной моделью для изучения структурно-функциональных модификаций биомембран, индуцированных воздействием цело­го ряда физико-химических агентов, являются эритроцитарные мембраны и клетки, что обусловлено следующими причинами:

— однородностью мембранного препарата, легкостью его по­лучения с сохранением нативных свойств;

— выполнением эритроцитарными мембранами различных функций: барьерной, транспортной, рецепторной, механической, метаболической и др.;

— наличием в эритроцитарных мембранах и клетках фер­ментных систем, регулирующих энергетические, окислительные процессы, транспорт ионов, пероксидное окисление липидов; ге­нерирующих и утилизирующих активные формы кислорода.

Тени эритроцитов, полученные путем гипоосмотического ге­молиза и отмытые от гемоглобина в изотоническом буфере, со­держат около 50 % белков, 43 % липидов и 7 % углеводов. Белковые компоненты мембраны были идентифицированы ме­тодом электрофореза в ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия. В соответствии с локализацией их подразделяют на пе­риферические и интегральные (см. главу 1). Периферические белки расположены на поверхности мембраны и им соответству­ют полипептидные полосы 1, 2, 4, 5 и 6. Интегральные белки погружены в липидный бислой и в некоторых случаях пронизы­вают его. Основным интегральным белком является белок по­лосы 3, осуществляющий транспорт анионов через мембрану. Его N-конец находится с цитоплазматической стороны, а С-конец погружен в бислой с наружной стороны мембраны. Перифери­ческие белки взаимодействуют друг с другом, образуя двумерный каркас, выстилающий внутреннюю поверхность эритроцитарной мембраны, который называют мембранным скелетом. Он содер­жит около 50 % общего количества белков эритроцитарной мем­браны. Его основными компонентами являются спектрин (поло­сы 1 и 2), актин (полоса 5), а также белки полосы 4.1. и 4.9. (см. раздел 1.2.1).

Липиды в мембранах эритроцитов находятся почти исклю­чительно в форме бислоя. По данным ЯМР, в эритроцитах чело­века таких липидов не менее 97 %. Вязкость липидного бислоя мембран эритроцитов выше, чем для других мембран. Это обус­ловлено высоким содержанием в них холестерина. В табл. 2—4 “Приложения” дана подробная количественная характеристика состава липидов и фосфолипидов мембран эритроцитов млеко­питающих, а также жирнокислотного состава фосфолипидов в эритроцитах человека и быка.

Лабораторная работа № 1

Выделение эритроцитарных мембран из крови доноров

Материалы и оборудование: кровь доноров с антикоагулян­том, хлорид натрия, трисгидроксиметиламинометан (трис), соля­ная кислота, этилендиаминтетраацетат (ЭДТА), центрифужные пробирки, центрифужные весы, центрифуга MPW-360, центри­фуга ЦЛР-1.У 4.2, pH-метр, пастеровские пипетки, фильтроваль­ная бумага.

Ход работы

Кровь с антикоагулянтом (3,8 %-ный раствор цитрата на­трия в соотношении кровь: цитрат — 9:1) необходимо центри­фугировать при 3000 об/мин на центрифуге MPW-360 в течение 10 мин. Плазму и верхний слой лейкоцитов аккуратно отобрать пастеровской пипеткой и удалить. Эритроциты три раза промыть охлажденным раствором, содержащим 0,145 моль/л NaCl в 0,02 моль/л трис-HCl буфере (pH 7,6 при 20 ’С), каждый раз осаж­дая клетки в том же режиме (при 3000 об/мин в течение 10 мин). Мембраны эритроцитов получают с помощью гипоосмотического гемолиза их раствором, содержащим 10 ммоль/л ЭДТА в 10 ммоль/л трис-HCl буфере (pH 7,6 при 20 °С). Для этого один объем отмытых эритроцитов быстро и энергично перемешать с 20 объемами охлажденной до +4 °С гемолизирующей среды и выдержать при этой температуре в течение 15 мин. Гемолизат центрифугировать на центрифуге ЦЛР-1 У4.2 при 18000 об/мин в течение 15 мин. Надосадочную жидкость удалить, а осадок мембран промыть три раза 20 объемами 10 ммоль/л трис-НС1 буфера (pH 7,6 при 20 °С), каждый раз осаждая мембраны в том же режиме.

В экспериментах использовать свежеприготовленную суспен­зию мембран.

Препараты мембран эритроцитов можно получить с помощью метода молекулярного сита. Для этого применяют гель-хрома­тографию на сефарозе 4В (“Pharmacia”, Швеция). Сефароза 4 В представляет собой гель агарозы, которая поставляется в набух­шем состоянии. Преимущество этого геля по сравнению с други­ми носителями для хроматографии заключается в его способнос­ти разделять комплексы биополимеров, полисахариды, мембра­ны и фрагменты клеток. Для эффективного отделения гемогло­бина от мембран необходимо лизировать эритроциты не менее, чем двумя объемами буфера. Установлены оптимальные усло­вия для разделения на сефарозе 4В: 4 ммоль/л фосфатный буфер (pH 7,5). На колонку размером 1,5x5,1 см можно наносить до 1 мл гемолизата (гемолизат должен быть приготовлен из расчета 1 объем эритроцитов : 1 объем гемолизирующей среды), при этом выход мембран составляет до 1 мл. Методом электрофоре­за в ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия показано, что мембраны, выделенные гель-хроматографией, содержат тот же набор белков, что и мембраны, полученные методом промывания и центрифугирования.

Лабораторная работа № 2

Определение концентрации белка плазматических мембран по методу Лоури

При выделении препарата мембран оценивают количествен­ный выход белка. Метод Лоури (1951) - наиболее распростра­ненный и высокочувствительный метод определения концен­трации белка, основанный на измерении интенсивности ок­раски раствора, зависящей от концентрации белка. Принцип метода заключается в том, что при взаимодействии белка с реактивами, используемыми в определении, осуществляются по меньшей мере две цветные реакции на белок. Одна из них — биуретовая реакция между пептидными группами и ионами меди. Возникающая сине-фиолетовая окраска обусловлена об­

разованием комплексного соединения — биуретового медно­го комплекса:

Такое комплексное соединение претерпевает в щелочной сре­де енолизацию по схеме:

Две молекулы диенольной формы биурета взаимодействуют с гидроксидом меди (II) и образуют комплексное соединение, в ко­тором координационные связи образованы за счет электронных пар атомов азота-иминных групп:

Такие медные комплексы обладают преимущественно фиоле­товой и синей окраской.

Вторая реакция — это реакция реактива Фолина с тирозино- выми и цистеиновыми радикалами молекулы белка. Это реак­ция восстановления смеси фосфорно-вольфрамовой и фосфорно­молибденовой кислот (реактив Фолина) с образованием комп­лексного соединения синего цвета. Полагают, что в реакции вос­становления принимают участие комплексные соединения меди, возникающие при взаимодействии белка со щелочным раство­ром сульфата меди. Эта реакция не очень специфична, но высо- нечувствительна. Преимущество метода Лоури состоит в возмож­ности определения белка в сильно разбавленных растворах (де­сятки мкг).

Материалы и оборудование: вольфрамат натрия Na₂WO/2H₂O, молибдат натрия Na₂MoO₄‘2H₂O, 80 %-ная фосфорная кислота, концентрированная соляная кислота, сульфат лития, бром, гид­роксид натрия, карбонат натрия, тартрат натрия, сульфат меди, бычий сывороточный альбумин, суспензия мембран, фотоэлект­роколориметр КФК-3 или спектрофотометр СФ-46, стеклянные кюветы для КФК, стеклянные пробирки, пипетки, фильтроваль­ная бумага.

Ход работы

Реактив Фолина готовят следующим образом: 100 г вольфра­мата натрия и 25 г молибдата натрия растворяют в 700 мл воды в круглодонной колбе на 1 л, снабженной пришлифованным хо­лодильником Либиха. Прибавляют 50 мл 80 %-ной фосфорной кислоты и 100 мл концентрированной соляной кислоты. Поме­щают в колбу несколько капилляров. Смесь кипятят в колбе с обратным холодильником в течение 10 ч. Далее прибавляют 150 г сульфата лития, 50 мл воды и несколько капель брома. Для удаления избытка брома кипятят содержимое колбы в течение 15 мин без обратного холодильника под тягой. Раствор охлажда­ют, доводят водой до 1 л и пропускают через стеклянный фильтр. Реактив Фолина хранят в химической посуде из темного стекла. На всех этапах приготовления реактива цвет реакционной смеси должен быть желтым. Реактив Фолина титруют 1 н раствором щелочи и на основании полученных данных рассчитывают его кислотность. Перед использованием реактив Фолина разбавля­ют водой до кислотности, соответствующей 1 н раствору соляной кислоты.

Далее готовят рабочий раствор: в цилиндр на 100 мл налива­ют 50 мл 2 %-ного раствора Na₂CO₃, в отдельную пробирку — 0,5мл 2 %-ного тартрата натрия и 0,5 мл 1 %-ного сульфата меди. Содержимое пробирки выливают в цилиндр и образовав­шейся смесью ополаскивают пробирку и опять выливают в ци­линдр. Смесь перемешивают и оставляют на 10 мин,

В пробирки разливают по 0,1 мл суспензии мембран, затем — по 0,1 мл 0,4 н раствора NaOH (пробирки можно нагреть для лучшего растворения белка). Добавляют бидистиллированную воду до 0,4 мл. Смешивают с 2 мл рабочего раствора, перемеши­вают содержимое пробирок и оставляют при комнатной темпе­ратуре на 10 мин. Затем добавляют 0,2 мл реактива Фолина, перемешивают и оставляют на 30—40 мин для развития окрас­ки. Измеряют оптическую плотность растворов при длине волны 750 нм на спектрофотометре или фотоэлектроколориметре. Со­держание белка в пробах определяют по калибровочному графи­ку, построенному с использованием бычьего сывороточного аль­бумина. Для этого готовят серию растворов белка с содержанием от 20 до 400 мкг в 1 мл. Определение ведут так же, как и для опытных растворов (см. выше), количество повторностей для каждой концентрации белка — не менее 5. Строят калибровоч­ный график, откладывая по оси абсцисс содержание белка в про­бе, а по оси ординат - ее оптическую плотность при 750 нм.

Лабораторная работа М 3

Количественное определение белка по биуретовой реакции

Материалы и оборудование: сульфат меди, гидроксид натрия, хлорид натрия, тартрат натрия-калия, йодид калия, бычий сыво­роточный альбумин, суспензия мембран, фотоэлектроколориметр КФК-3 или спектрофотометр СФ-46, стеклянные кюветы для КФК, стеклянные пробирки, пипетки, фильтровальная бумага.

Ход работы

Для приготовления биуретового реактива в мерную посуду на 250 мл вносят 0,375 г сульфата меди; 1,5 г тартрата натрия- калия и растворяют в 150 мл воды. При энергичном перемеши­вании добавляют 75 мл 10 %-ного раствора NaOH и 1 г йодида калия и доводят содержимое до 250 мл водой. Реактив хранят в полиэтиленовом сосуде, покрытом изнутри парафином, так как он не подлежит длительному хранению.

В пробирки помещают по 0,2 мл исследуемого раствора, со­держащего белок, доводят бидистиллированной водой до 1 мл, добавляют 4 мл биуретового реактива и перемешивают. В конт­рольную пробирку вместо белка наливают воду. Через 30 мин измеряют оптическую плотность проб (развивается сине-фиоле­товое окрашивание за счет пептидных связей) при длинах волн 540—650 нм против контроля (для более точного определения зарегистрировать спектр поглощения проб и выявить про­тив контрольного раствора).

Содержимое белка в пробах определяют по калибровочному графику с использованием бычьего сывороточного альбумина. Стандартные растворы бычьего сывороточного альбумина долж­ны содержать от 1 до 10 мг белка в 1 мл 1 %-ного раствора хло­рида натрия. Определение ведут так же, как в случае опытных проб.