Фоточувствителъностъ ацетилхолинэстеразы эритроцитарных мембран в присутствии фосфолипазы D и аскорбиновой кислоты

К группе естественных модификаторов, изменяющих липид­ный состав мембран в нативной клетке, относятся липидперено- сящие белки, ферменты обмена фосфолипидов — фосфолипазы, диметилазы и др., а также системы обмена холестерина.

Фосфолипазы — обширный класс липолитических фермен­тов, имеющих первостепенное значение для регулирования раз­нообразных процессов жизнедеятельности всех живых организ­мов. Это связано с многообразием их функций. Во-первых, они участвуют в обновлении мембранных фосфолипидов, что опреде­ляет стабильность и биохимическую активность мембран и в ко­нечном итоге функциональное состояние целой клетки. Во-вто­рых, продукты фосфолипазной реакции (жирные кислоты, лизо- фосфатидилхолин, холин, диглицерид, фосфорилхолин и др.) яв­ляются мощными эффекторами мембранных процессов. В-треть­их, фосфолипазам принадлежит ключевая роль в биосинтезе про­стагландинов, лейкотриенов и других продуктов превращения арахидоновой кислоты. Так, реакцию гидролиза фосфолипидов, приводящую к образованию свободной арахидоновой кислоты, катализирует фосфолипаза А₂, Эта реакция является лимитиру­ющей стадией в “каскаде” ферментативных реакций биосинтеза физиологически активных эйкозаноидов.

Вместе с тем всестороннее изучение структурно-функциональ­ных свойств фосфолипаз имеет важное не только теоретическое, но и практическое значение для медицины и фармакологии. Мно­гие патологические процессы, в том числе ишемия и воспаление, сопровождаются увеличением активности внутриклеточных фос­фолипаз.

Фосфолипазы (фосфатидацилгидролазы, КФ 3.1) — фермен­ты, катализирующие гидролитическое расщепление сложноэфир­ных связей в различных фосфолипидах. Фосфолипазы А_р А₂, В, С, D различают в зависимости от того, какая из четырех эфир­ных связей, имеющихся в молекулах фосфатидов, гидролизуется ферментом. Существует также цифровая номенклатура фосфо­липаз соответственно положению расщепляемой сложноэфирной связи: 1, 2, 3, 4 (рис. 39).

Фосфолипазы различного происхождения способны также катализировать реакции ферментативного трансалкилирования (фосфолипаза D) и трансацилирования (другие фосфолипазы).

Липолитические ферменты гидролизуют водонерастворимые субстраты, следовательно, они должны функционировать на гра­нице раздела фаз. Обычно их молекулы состоят из трех участ­ков: гидрофобного, который создает необходимую ориентацию фермента на поверхности субстрата, и активного центра, находя-

Рис. 39. Схема действия и номенклатура фосфолипаз

щегося вблизи головки, но не идентичного ей, и гидрофильного хвоста, стабилизирующего ориентацию белковых молекул.

По аналогии с другими гидролитическими ферментами для фос­фолипаз предполагают наличие различных типов активных цент­ров: серингистидинового, карбоксил-карбоксилатного, Zn²'-Kap6o- ксилатного, цистеин-гистидинового. Именно с участием этих групп происходит осуществление каталитического акта гидролитически­ми ферментами.

Фосфолипаза D (фосфатидилхолин-фосфатидатгидролаза, фос­фолипаза 4) гидролизует эфирную связь между фосфатной груп­пой и гидрофильным спиртом в фосфоглицеридах и соответству­ющую связь в сфингомиелинах. Фермент был впервые обнаружен в корнеплоде моркови и листьях шпината, он содержится также и в других растениях: свекле, брюссельской и савойской капусте.

Рис. 40. Ферментативная актив­ность ацетилхолинэстеразы эритро­цитарных мембран, модифициро­ванных фосфолипазой D, после УФ- облучения в дозе 1,5 кДж/м²: 1 — контроль (нативный фермент); 2 — УФ-облучение; 3 — модификация фосфолипазой D; 4 — УФ-облуче- ние модифицированных фосфоли­пазой D мембран

На рис. 49 показаны УФ-индуцированные изменения функ­циональной активности АХЭ мембран эритроцитов, модифици­рованных фосфолипазой D, в интактном состоянии и после УФ- облучения в дозе 1,5 кДж/м². Предварительная обработка эрит­роцитарных мембран раствором фосфолипазы D в концентра­ции 10*^fi моль/л (pH 5,6; 0,03 моль/л СаС1₂) с последующим уда­лением модифицирующего -агента путем центрифугирования практически не влияет на величину каталитической активности мембранной АХЭ: уровень изучаемого параметра — 105 % по отношению к таковому для нативных мембран (100 %). Однако УФ-облучение эритроцитарных мембран, обработанных фосфо­липазой D, индуцирует резкое снижение функциональной актив­ности АХЭ до 8 %. Следовательно, воздействие УФ-света на мем­браносвязанный фермент после модификации липидной фазы мем­бран вызывает его инактивацию, т. е. выявляется эффект, проти­воположный наблюдаемым изменениям (активация) исследуе­мого параметра при облучении интактных мембран.

Аналогичные результаты были получены и при исследова­нии функциональной активности АХЭ мембран эритроцитов, мо­дифицированных фосфолипазой, в нативном состоянии и после УФ-облучения в дозе 3,0 кДж/м² (рис. 41). Воздействие УФ-из­лучения в дозе 3,0 кДж/м² на эритроцитарные мембраны, обра­ботанные фосфолипазой D, приводит к практически полному ин­гибированию фермента. Следовательно, и в этом случае модифи­кация липидной фазы мембран вызывает инактивацию АХЭ — эффект, противоположный изменениям активности белка, реги­стрируемым при облучении интактных мембран.

На рис. 42 показаны изменения ферментативной активности мембраносвязанной АХЭ после обработки мембран фосфолипа­зой D и воздействия УФ-света в дозе 4,5 кДж/м². Видно, что в результате УФ-облучения модифицированных мембран фоточув­ствительность фермента изменяется незначительно. Активность АХЭ в интактных мембранах после облучения снижается на 44 %, а в обработанных фосфолипазой — на 52 % по отношению к контрольному образцу.

Рис. 41. Каталитическая актив­ность ацетилхолинэстеразы эрит­роцитарных мембран, модифициро­ванных фосфолипазой D, после УФ- облучения в дозе 3,0 кДж/м²: 1 — контроль (нативный фермент); 2— УФ-облучение; 3 — модификация фосфолипазой D; 4 — УФ-облуче­ние модифицированных фосфоли­пазой D мембран

Рис. 42, Функциональная актив­ность ацетилхолинэстеразы эритро­цитарных мембран, модифицирован­ных фосфолипазой D, после УФ-об­лучения в дозе 4,5 кДж/м²: 1 — контроль (нативный фермент); 2 — УФ-облучение; 3 — модификация фосфолипазой JD; 4 — УФ-облуче­ние модифицированных фосфолипа­зой D мембран

Рис.

На рис. 43 представлены данные, характеризующие зависи­мость функциональных свойств мембранной АХЭ от дозы облу­чения для интактных и обработанных фосфолипазой D эритро­цитарных мембран. Полученные результаты свидетельствуют о том, что УФ-чувствительность мембраносвязанной ацетилхолин­эстеразы существенным образом зависит от структурного состо­яния фосфолипидных компонентов биомембраны.

Фосфолипаза D катализирует отщепление гидрофильного спирта от фосфоглицеридов и сфингомиелинов. В результате отщепления полярных головок от молекул фосфолипидов мо­гут нарушаться электростатические взаимодействия фермента с молекулами окружающих его фосфолипидов, в частности, кис­лого липида — фосфатидилсерина, являющегося, по-видимому, аннулярным липидом для ацетилхолинэстеразы. Фосфатидил­серин, а также фосфатидилэтаноламин локализованы преиму­щественно во внутренней половине липидного бислоя. Можно предположить, что гидролиз фосфолипидов и фосфатидилсери­на не вызывает конформационных изменений молекул фермен­та, затрагивающих его активный центр, поэтому активность АХЭ при обработке мембран фосфолипазой практически не изменя­ется. Необходимо отметить, что обработка мембран фосфолипа­зой индуцирует изменения упаковки и подвижности фосфоли­пидов, вязкости и асимметрии липидной фазы, белок-липидных взаимодействий. Воздействие УФ-излучения на модифицирован­ные мембраны приводит к нарушениям в функционировании мембраносвязанной АХЭ, отличающимся по направленности от таковых при облучении интактных мембран. Эти нарушения являются результатом изменения конформационного состояния продуктов гидролиза фосфолипидов в мембране при воздействии УФ-света.

Е. А. Лапшина, И. Б. Заводник (1995) установили, что взаи­модействие свободных жирных кислот (пальмитиновой, лаури- новой, каприловой) и их производных с эритроцитарной мембра­ной вызывает ингибирование АХЭ цельных эритроцитов и изо­лированных эритроцитарных мембран.

цитов малоновым диальдегидом, способным модифицировать амино- и сульфгидрильные группы белков, образуя ряд стабиль­ных и нестабильных аддуктов, внутри- и межбелковые сшивки, приводила к ингибированию активности АХЭ по бесконкурент­ному механизму.

Таким образом, выявляется различная УФ-чувствительность АХЭ интактных и модифицированных фосфолипазой D эритро­цитарных мембран, обусловленная нарушением нативной кон­формации фермента вследствие воздействия на него фотохими­ческих продуктов гидролиза фосфолипидов.

Большой интерес в настоящее время представляют вопросы, касающиеся всестороннего изучения процессов фотомодификации отдельных компонентов биомембран в присутствии химических соединений с различным механизмом действия, способных ини­циировать, усиливать или ослаблять фотохимические реакции. Од­ним из факторов системы низкомолекулярных регуляторов, вы­полняющих роль инициаторов, катализаторов, ингибиторов и влияющих на стадию инициирования, разветвления и обрыва цепи свободнорадикальных реакций, являются низкомолекулярные ком­поненты антиоксидантной системы (см. раздел 3.3).

Содержание аскорбиновой кислоты, обладающей чрезвычайно широким спектром антиоксидантных свойств, составляет в плаз­ме крови 50—200 мкмоль/л. Вместе с тем известно, что низкомо­лекулярные антиоксиданты способны проявлять свои защитные

Рис. 44. Ферментативная актив­ность ацетилхолинэстеразы эритроци­тарных мембран в присутствии аскор­биновой кислоты в различных кон­центрациях (моль/л): 1 — контроль (нативные мембраны); 2 — 0,5-Ю’³; 3 — 10~⁴; 4 — 10~⁵; 5— 10-°; 6— 10"^й

функции в широком интервале концентраций: от 10~² до 10“¹⁸ моль/л. На рис. 44 показаны изменения функциональной актив­ности АХЭ эритроцитарных мембран в присутствии аскорбата в различных концентрациях. Из анализа данных, представленных на этом рисунке, следует, что добавление к суспензии эритроци­тарных мембран аскорбиновой кислоты в концентрациях 0,5-ПУ'¹, IO^-1*, 10"^s, 10"^а моль/л индуцирует статистически достоверное сни­жение уровня каталитической активности АХЭ. Использование экзогенного агента в минимальной концентрации (10~⁸ моль/л) приводит к активации фермента на 93 % по отношению к конт­рольному образцу (100 %).

Витамины А,С, D и Р, при окислении и аутоокислении кото­рых образуются промежуточные радикальные формы (например, пероксид водорода), могут выполнять роль инициаторов окисле­ния и ускорять ПОЛ, увеличивая скорость зарождения цепей в мембранах. Кроме того, в присутствии ионов железа и меди, со­держащихся в эритроцитарной мембране, аскорбиновая кислота становится мощным прооксидантом, что указывает на необходи­мость in vivo надежной секвестрации свободных ионов металлов переменной валентности. Проявление аскорбатом анти- и про- оксидантных свойств зависит также от концентрации субстрата и условий протекания окислительных реакций.

Следовательно, в интервале используемых концентраций 0,5'10^-3—10"⁸ моль/л аскорбиновая кислота проявляет проокси- дантные свойства, что находит отражение в снижении функцио­нальной активности мембраносвязанной ацетилхолинэстеразы. Про­межуточные радикальные формы, образующиеся при окислении аскорбата, усиливают и ускоряют ПОЛ, в результате которого на­капливаются пероксидные продукты. Ацетилхолинэстераза при­надлежит к числу ферментов мембран, легко инактивируемых при пероксидном окислении ненасыщенных жирных кислот. Наибо­лее важные изменения в белковых молекулах, вызываемые окис­ленными липидами, заключаются в образовании комплекса окис­ленный липид — белок, ассоциации белковых молекул и разруше­нии аминокислот, в частности, содержащих SH-группы.

На рис. 45 представлены данные, полученные при исследова­нии уровня функциональной активности АХЭ эритроцитарных мембран, УФ-облученных в дозе 4,5 кДж/м² в присутствии ас­корбиновой кислоты. УФ-облучение интактных мембран вызы­вает снижение активности фермента на 44 %. Совместное дей-

Рис. 45. Изменения каталитической активности мембраносвязан­ной ацетилхолинэстеразы, УФ-облученной в присутствии аскорбата: 1 — контроль (нативные мембраны); 2— в присутствии аскорбата; 3 — УФ-об- лучение в присутствии аскорбата. Концентрация аскорбата, моль/л: а — 10~⁴; б — Ю'⁵; е— 10-“; г — Ю'⁸

ствие УФ-излучения и аскорбата в концентрациях 10"⁴, 10~^в, 10'° моль/л индуцирует полное ингибирование мембранной АХЭ. УФ-облучение мембран эритроцитов в комплексе с модифициру­ющим агентом (10"⁸ моль/л) приводит к резкому повышению функциональной активности белковой молекулы.

При изучении ПОЛ в мембранах митохондрий и микросом было установлено, что существенное усиление накопления перок-

сидных продуктов может быть вызвано добавлением солей двух­валентного железа, аскорбиновой кислоты и соединений, содер­жащих сульфгидрильные группы, например, цистеина или глу­татиона. В 1959 г. Оттоленги обнаружил, что накопление перок­сидов связано с наличием в изучаемой среде двухвалентного железа. Он предположил, что ионы Fe²⁺ оказывают каталитичес­кое действие на образование пероксидов. При этом Fe²⁺ окисля­ется до Fe³⁺, а функция аскорбиновой кислоты заключается в регенерации ионов за счет обратного восстановления Fe^;,+ до Fe²⁺. Ведущую роль ионов Fe²⁺ в процессе ПОЛ в биомембранах опре­деляет совокупность следующих реакций:

Следует подчеркнуть, что скорость ПОЛ определяется соот­ношением концентраций ионов Fe²⁺, гидропероксидов, свобод­ных радикалов RO₂‘. Ионы железа играют одновременно функ­цию про- и антиоксидантов. Их антиокислительное действие проявляется только при достаточно высоких концентрациях Fe²⁺ (>10‘⁵—10"⁴ моль/л).

По всей вероятности, ингибирование мембраносвязанной АХЭ при ее УФ-облучении в присутствии аскорбата (И)"⁴—10"® моль/л) представляет собой результат параллельного протекания перок­сидного фотоокисления ненасыщенных жирных кислот фосфоли­пидов и аскорбатзависимого ПОЛ с участием ионов Fe²⁺. Причем эти процессы взаимоусиливают друг друга. Антиоксидантный и активирующий эффекты аскорбата по отношению к уровню фун­кциональной активности мембраносвязанной АХЭ зарегистриро­ваны только в присутствии экзогенного агента в концентрации 10~⁸ моль/л. В данном случае реализуются процессы обезврежи­вания аскорбиновой кислотой активных форм кислорода (супе­роксидного анион-радикала, синглетного кислорода, гидроперок- сидного радикала, гидроксильного радикала, пероксидных ради­калов липидов), восстановления а-токоферильного радикала.

Изучение фоточувствительности мембраносвязанной АХЭ в присутствии химических агентов, модифицирующих липидную фазу мембраны, позволяет расширить современные представле­ния о молекулярных механизмах регулирования активности важ­нейших компонентов биомембран. На основании собственных эк- 166

Рис. 46. Схема процессов, приводящих к фотомодификации мемб­ранной ацетилхолинэстеразы

спериментальных и литературных данных предложена схема про­цессов, приводящих к фотомодификации мембранной АХЭ, учи­тывающая вклад УФ-превращений самого фермента, а также от­дельных структурных компонентов мембран (рис. 46). Кроме того,

Рис. 47. Модуляция фоточувствительности мембраносвязанной аце­тилхолинэстеразы

разработана схема модуляции фоточувствительности ацетилхо­линэстеразы путем модификации структурного состояния липид­ной фазы эритроцитарной мембраны в присутствии фосфолипа­зы D и аскорбиновой кислоты (рис. 47).

Выявлены важная роль микроокружения в процессах функ­ционирования АХЭ и возможность целенаправленного регули­рования степени ее УФ-чувствительности путем введения в изу­чаемую систему экзогенных агентов, модифицирующих конфор­мацию ближайших “соседей” фермента в биомембране. Исследо­вания подобного рода полезны при обсуждении вопросов, касаю­щихся выяснения механизмов влияния УФ-излучепия на струк­турно-функциональное состояние эритроцитарных мембран в нор­ме и в присутствии ряда химических соединений. Они расширя­ют современные представления об особенностях фотохимических превращений белков-ферментов в составе мембран клеток и мо­гут быть использованы для разработки новых физико-химичес­ких подходов к мембранному скринингу разнообразных по своей природе и механизмам действия химических соединений, а так­же к выявлению структурных нарушений компонентов мембран, обусловленных действием указанных внешних факторов.

4.2.3.