ВЫДЕЛЕНИЕ И ФРАКЦИОНИРОВАНИЕ ЛИПИДОВ МЕМБРАН

Выделение липидов мембран осуществляют сразу после по­лучения мембранной фракции, которую необходимо защищать от действия протео- и липолитических ферментов, автоокисле­ния. Обычно все процедуры проводят при низкой температуре, поддерживая определенные значения pH и ионной силы.

Дальнейший анализ липидов проводят методами гидролиза и количественного определения компонентов сложных смесей фос­фолипидов. В результате избирательного гидролиза липидов мем­бран образуются продукты, которые можно разделить по поляр­ности или по остающимся неполярным группам. Описаны раз­личные способы щелочного или кислотного гидролиза мембран­ных липидов. При использовании ферментативного гидролиза (например, с помощью фосфолипаз) расщепляются только строго определенные связи при сохранении всех остальных.

Количественный анализ сложных смесей фосфолипидов про­водят хроматографическими методами. Для препаративных це­лей в основном используют хроматографию на колонках. Для микроаналитических исследований успешно применяют тонко­слойную хроматографию, с помощью которой можно разделить практически все классы липидов, локализовать и идентифици­ровать их при использовании специальных реактивов.

Для тонкослойной хроматографии липидов применяют слои мелкозернистого силикагеля (силикагель Н). Для аналитических целей используют слой сорбента толщиной 0,25 мм, для препара­тивных — 0,5 мм. Размер стеклянной пластинки для разделения чаще всего — 20x20 см. Для разделения различных классов ли­пидов используют разные системы растворителей. Например, по­лярные фрсфолипиды и гликосфинголипиды разделяют в смеси хлороформ—метанол, содержащей аммиак или разведенную ук­сусную кислоту. Элюирующая способность смесей растворителей определяется полярностью ее составных компонентов.

По элюирующей способности растворители располагаются в следующем возрастающем порядке: петролейный эфир, цикло­гексан, четыреххлористый углерод, толуол, бензол, хлороформ, диэтиловый эфир, этилацетат, ацетон, н-пропанол, этанол, мета­нол, вода. После пропускания растворителей пластинку высуши­вают на воздухе и идентифицируют липиды с помощью окраши­вания специфическими реагентами. Для количественного опре­деления фосфолипидов, разделенных тонкослойной хроматогра­фией, используют спектрофотометрические методы.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

1. Какие методы исследования биомембран относят к биохимичес­ким?

2. Каковы особенности биофизических методов изучения биомемб­ран?

3. Дайте характеристику оптических методов исследования биомем­бран.

4. Охарактеризуйте основные этапы выделения и разделения био­мембран.

5. Какие методы используют для выделения мембран из гомогена­тов клеток и тканей?

6. Какие критерии применяют для оценки чистоты мембранных фракций?

7. Какие требования предъявляют к маркерным ферментам? На­зовите маркерные ферменты различных мембранных структур клетки.

8. С какой целью в мембранологии применяют детергенты? Что они представляют собой, каковы их свойства?

9. Почему критическую концентрацию мицеллообразования счита­ют важной характеристикой детергентов?

10. Опишите принципы, классификацию и области применения ме­тодов хроматографии и электрофореза для исследования биомембран.

11. Охарактеризуйте стадии выделения, разделения и количествен­ного определения липидного состава мембран.

12. Какова физическая природа люминесценции?