1.2.1. Классификация, структура и функции мембранных белков

Белки обеспечивают выполнение мембранами их специфичес­ких функций. Поэтому содержание и типы белков в различных мембранах значительно варьируют. Так, в миелиновой мембране, выполняющей функцию изолятора, белки составляют около 20 % массы мембраны.

Обычно мембранные белки подразделяют на наружные (пери­ферические) и внутренние (интегральные). При этом критерием служит степень жесткости обработки, необходимой для извлече­ния этих белков из мембраны. Периферические белки высвобож­даются при промывании мембран буферными растворами с низ­кой ионной силой, с низким или высоким значением pH, в при­сутствии растворов хелатирующих агентов (ЭДТА), связывающих двухвалентные катионы. Такие белки контактируют с поверх­ностью мембраны в основном за счет слабых электростатических взаимодействий с полярными головками липидных молекул либо с молекулами других белков. В определенных условиях с биомем­бранами могут взаимодействовать некоторые водорастворимые ци­топлазматические белки. Поэтому возникла необходимость в до­полнительной классификации периферических белков, которые делятся на две группы: собственно периферические и поверхност­ные. Собственно периферические белки, как правило, связаны с мембраной электростатическими силами и могут быть частично погружены в ее гидрофобную область. Поверхностные белки при­крепляются к мембране только за счет электростатических взаи­модействий. К периферическим белкам относят гексокиназу, свя­занную с белком порином, локализованным во внешней мембране митохондрий; цитохром С, который образует комплекс с мембран­ным белком цитохромоксидазой; креатинфосфокиназу, взаимо­действующую с кардиолипином внутренней мембраны митохонд­рий.

По функциям периферические белки делятся на следующие группы:

1) регуляторно-сигнальные (белки экстраклеточного матрикса);

2) структурно-каркасные (актин-спектриновые комплексы);

3) белки, обеспечивающие подвижность клеток и субклеточ­ных структур (белки микротрубочек и микрофиламентов).

Таблица З

Белковый и липидный состав некоторых мембран животных и бактериальных клеток

Для высвобождения из мембраны интегральных белков необ­ходимо использовать детергенты или органические растворите­ли.

нентами мембраны. Особенностью их структуры является высо­кое содержание а-спиральных участков и участков с конформа­цией статистического клубка. Степень погружения интеграль­ных белков в липидный матрикс определяется их аминокислот­ным составом (количеством аминокислотных остатков с непо­лярными боковыми радикалами) и трехмерной пространствен­ной структурой. Эти белки выполняют в мембране транспорт­ную, рецепторную и ферментативную функции. К ним относят гликофорины, АТФазы, цитохром Ь₅, родопсин, бактериородоп- син и др. Следует отметить, что с высоким разрешением уста­новлена структура только бактериородопсина, однако и в этом случае положение белка относительно липидного бислоя не оп ­ределено однозначно. Детальное исследование интегрального мембранного белка должно включать экспериментальное изуче­ние его топографии. Для этого используют целый арсенал мето­дов: протеолиз, иммунологические методы (применение монокло­нальных и поликлональных антител против пептидов, соответ­ствующих определенным областям белка), химическую модифи­кацию (например, солями диазония), генетические подходы.

Различия периферических и интегральных белков определя­ют степень связывания их с мембраной, но не способ их прикреп­ления к бислою. На рис. 6 показаны способы прикрепления бел­ков к мембране:

1 — связывание с “якорными” белками, погруженными в би- слой. Примеры: Fj-часть Ы⁺-АТФазы связана с Fg-частью, погру­женной в мембрану; сукцинатдегидрогеназа, некоторые белки цитоскелета;

2 — связывание с поверхностью бислоя. Эти взаимодействия имеют либо электростатическую природу (а), например, миели­новый основный белок, либо гидрофобную, но практически без погружения в бислой (б), например, пируватоксидаза, фосфоли­пазы;

3 — связывание с помощью гидрофобного “якоря”.

4 — пересечение мембраны трансмембранными белками. Гли- кофорин имеет одиночный трансмембранный сегмент (а), а лак- топермеаза и бактериородопсин — несколько (б).

Рис. 6. Способы прикрепления белков к мембране. Объяснения в тексте

Мембранные белки эукариот могут быть ковалентно связаны с липидами. Их подразделяют на три группы:

— белки, связанные с миристиновой кислотой (14:0): катали­тическая субъединица сАМР-зависимой протеинкиназы, NADPH- цитохром Ь₅-редуктаза;

— белки, связанные с пальмитиновой кислотой (16:0): родо­псин, анкирин;

— белки, связанные с гликозилфосфатидилинозитолом: аце- тилхолинэстераза, 5'-нуклеотидаза, щелочная фосфатаза.

Белки, связанные с жирными кислотами, по-видимому, лока­лизованы в основном на цитоплазматической поверхности плаз­матической мембраны, а белки, взаимодействующие с фосфатиди­линозитолом, — на наружной. Миристиновая кислота присоеди­няется к белку через амидную связь с N-концевым глицином, паль­митиновая — путем образования тиоэфирной связи с цистеином или гидроксиэфирной связи с серином и треонином. Эти амино­кислотные остатки расположены внутри основной части полипеп­тида вблизи трансмембранных участков, как правило, на цито­плазматической стороне. Связь белков с производными фосфати­дилинозитола локализована на С-концевом участке аминокисло­ты. Липиды присоединяются к белку либо посттрансляционно, либо одновременно с трансляцией на рибосомах (котрансляционно).

Поверхностные белки клеток млекопитающих, а также боль­шинство рецепторов и транспортных белков почти всегда гликози-

лированы. Олигосахаридные остатки могут защищать белки от про­теолиза или участвовать в узнавании и адгезии.

— N-гликозидные олигосахариды, связанные с белками через амидную группу аспарагина;

— О-гликозидные олигосахариды, связанные через гидро­ксильные группы серина или треонина.

Гликофорин А мембраны эритроцитов гликозилирован пу­тем присоединения одного N-гликозидного олигосахарида и 15 се- рин/треонин-связанных олигосахаридов.

Наиболее детально исследован белковый состав эритроцитов млекопитающих (табл. 4).

Классической работой по электрофоретическому разделению белков мембран эритроцитов человека является исследование Фейрбанкса и соавт. (1971), в котором предложена номенклату­ра полипептидных полос, выявляемых в солюбилизированной с помощью додецилсульфата натрия (ДСН) мембране. Этой номен­клатурой пользуется в настоящее время большинство ученых. Наличие сетчатой структуры, выстилающей внутреннюю повер­хность мембраны эритроцита, было обнаружено непосредственно с помощью электронной микроскопии после обработки клеток неионным детергентом тритоном Х-100. При определенных экспериментальных условиях (в среде с высокой ионной силой и при низкой температуре) применение этого детергента позволя­ет полностью солюбилизировать липидный бислой и интеграль­ные белки. При этом остается сеть белков, сохраняющая исход­ную форму клетки, которая представляет собой мембранный ске­лет (каркас) эритроцита. Он тестируется в виде двухмерной сети филаментов, длина которых зависит от особенностей приготов­ления препарата для микроскопии. Необходимо отметить, что белки, близкородственные компонентам цитоскелета эритроци­тов, обнаружены в ряде неэритроидных клеток. В связи с уни­версальностью данной системы следует более подробно рассмот­реть структуру и свойства некоторых цитоскелетных белков.

1.2.2.