Мембранное фосфорилирование и электронный транспорт

Важным и наиболее тщательно изученным процессом с участи­ем молекулярных машин является образование аденозинтрифосфата (АТФ или АТР) — универсальной энергетической «разменной монеты» в биологических системах, и гидролиз АТР, который удовлетворяет энергетические потребности всех энергоакцепторных процессов, как, например, синтез низко- и высокомолекулярных соединений, созда­ние неравновесного распределения ионов металла и других низкомо­лекулярных частиц внутри гетерогенных тканей и внутриклеточных структур, механическое движение, люминесценция и т.д.

Рис. 4.14. Структуры АТР и ADP. Схема синтеза и гидролиза АТР

На рис. 4.14 показаны структура ATP и ADP и схемы синтеза и гидролиза АТР, т. е. схемы реакции

Как уже было ранее подчеркнуто, все биологические молекуляр­ные машины являются машинами химическими.. Они осуществляют сопряжение между энергодонорными и энергоакцепторными химичес­кими реакциями. В классической физической химии такое сопряжение требует присутствия общего интермедиата, участвующего в обеих ре­акциях.

Рассмотрим простейший пример с двумя мономолекулярними реакциями

Здесь К_{ и К₂ — константы равновесия реакций (4.21) и (4.22) соответственно.

Пусть реакция (4.21) — энергодонорная, а реакция (4.22) — энергоакцепторная. Детальный математический анализ этой ситуации можно найти в [31]. Здесь мы ограничимся объяснением, несколькими утверждениями и общим выводом.

Предположим, что наша система исходно находится в состоянии химического равновесия. Сдвиг равновесия энергоакцепторной реак­ции может быть вызван, например, повышением концентрации одного из реагентов, участвующих в энергодонорной реакции.

Энергия субстрата первоначально сохраняется в форме потенци­альной энергии химических связей молекулы. Энергия, освобождаемая в ходе энергодонорного процесса, распределяется по огромному чи­слу тепловых степеней свободы общего резервуара, и не поступает

непосредственно для выполнения работы или повышения потенциаль­ной энергии других реагентов. Элементарные акты энергодонорного и энергоакцепторного процессов могут быть разделены во времени и пространстве. Возникает вопрос: как может энергодонорная реакция стимулировать преодоление активационного барьера в ходе энергети­чески невыгодного химического превращения?

Следует отметить, что в случае энтропийного механизма непря­мого сопряжения обе реакции могут быть как эндотермическими, так и экзотермическими. Для обеспечения сопряжения определяю­щую роль играет только знак изменения свободной энергии. Полная энергия системы может либо понижаться, либо возрастать, в зави­симости от природы элементарного акта энергоакцепторной реакции. Энергия, необходимая для осуществления химического превращения либо забирается из окружения (термостаты) или ему передается. Из­менения концентрации приводят только к изменению вероятности соответствующих актов. Молекулы, участвующие в элементарных ак­тах с «энергоакцепторной стороны», выбирают «горячие» частицы из реагентов реакционной смеси. Они работают, на самом деле, как демон Максвелла (см. раздел 3.3). Химическая система освобождается от «информационного мусора», осуществляя превращение субстрата в продукт, и «демон Максвелла» может снова продолжать свою работу.

Однако количественный анализ показывает, что во всех случаях энтропийный механизм непрямого сопряжения характеризуется низ­кой эффективностью процесса.

Вернемся теперь к синтезу АТР. Подавляющая часть молекул АТР (около 85 %) в животных бактериальных и растительных клетках синтезируются в мембранных внутриклеточных структурах (мембран­ное фосфорилирование). В аэробных организмах непосредственными источниками энергии (энергодонорные процессы) являются опреде­ленные стадии окисления пищи. В растениях и фотосинтезирующих бактериях первичными источниками являются, конечно, кванты све­та, энергия которых, после возбуждения хлорофилла, превращает­ся в энергию в окислительно-восстановительных цепях электронного транспорта (ЦЭТ) в тилакоидных мембранах хлоропластов.

Рис. 4.15. Схематическое изображение митохондрии

На рис. 4.15 и 4.16 изобра­жены схемы поперечного сечения митохондрии и ее ЦЭТ, локали­зованной во внутренней мембране митохондрий. Митохондрии явля­ются внутриклеточными органел­лами. Их внутренние мембраны содержат «электронные перенос­чики» и ферменты, катализирую­щие синтез АТР из аденозинди- фосфата (ADP) и неорганического фосфата Р; (см. рис. 4.14). Каждая

ЦЭТ содержит три идентичных ATP-синтезирующих ферментных ком­плекса (АТРсинтаза). Этот же фермент катализирует и гидролиз АТР. В этом случае его называют АТРазой. Митохондрия представляет собой продолговатую, эллипсоидальную частицу (длинная ось — примерно 3 микрона, короткая ось — примерно 1 микрон). Она окружена двумя

Рис. 4.16. Схема электронного и протонного переноса во внутренней мембране митохондрии

мембранами: гладкой наружной мембраной и внутренней мембраной с кристами, образующими довольно сложный рельеф. Внутренняя мембрана одной митохондрии содержит около 1 500 ЦЭТ. Каждая ЦЭТ может быть разделена на несколько частей, называемыми обычно «комплексами Грина». Два субстрата ЦЭТ, NADH и сукцинат, взаимо­действуют с ЦЭТ через первый и второй комплексы Грина, соответ­ственно. Эти комплексы содержат флавопротеины (FP). Их активными центрами являются флавинмононуклеотид (FMN, комплекс 1), флави- наден инд и нуклеотид (FAD, комплекс 2), а также железосерные белки (Fe-S-белки), обозначаемые N (комплекс 1) и S (комплекс 2). Два пути электронного транспорта от NADH и сукцината соединяются в «уби- хинонном котле». Убихинон (UQ), низкомолекулярный электронный переносчик (называемый также «коэнзимом Q₁₀» или просто коэн­зимом Q), переносят электроны между центрами, локализованными на разных сторонах внутренней мембраны митохондрии, одновременно обеспечивая перенос протонов поперек мембраны (рис.

ЦЭТ митохондрий содержит три центра сопряжения, локализо­ванные в первом, третьем и четвертом комплексах Грина (см. рис. 4.15 и 4.16). В первом комплексе центром сопряжения служит Fe-S белок N-2, во втором — Fe-S белок «Риске», а в четвертом — цитохром- С-оксидаза. Прохождение электрона через центр сопряжения сопро­вождается понижением его энергии, что впоследствии использует­ся соответствующей АТРсинтазой для синтеза АТР Перенос одного электрона на центр сопряжения от предыдущего переносчика означает восстановление первого и окисление последнего.

Энергодонорная и энергоакцепторная реакции могут быть разоб­щены весьма слабыми воздействиями: нагреванце до 50° С, повторным замораживанием и оттаиванием, старением. В разобщенных митохон­дриях энергия, освобождаемая при окислении NADH или сукцината диссипирует, и АТР не синтезируется. В разобщенном состоянии, ко­гда процесс электронного транспорта не связан с синтезом АТР, его скорость резко возрастает. Образование АТР не идет также и в сопря­женных митохондриях в отсутствие, например, субстратов фосфорили­рования (ADP или P_f), но в этом случае скорость электронного пере­носа понижается. Таким образом, не только энергодонорная реакция необходима для реализации энергоакцепторной, но и, наоборот, энер­гоакцепторная реакция необходима для реализации энергодонорной! Это совершенно необычная ситуация для классических химических реакций. Это напоминает поведение двух соединенных шестеренок, которые не могут вращаться друг без друга. Как будет показано далее, для процессов трансформации энергии в биологических системах эта механическая аналогия вполне реальна.

Детальные кинетические исследования, проведенные в лабора­тории Чанса [54,55], показали, что отсутствие сопряжения ускоряет перенос электрона через центр сопряжения. Эти стадии и определяют скорости электронного транспорта в митохондриях.

На рис. 4.17 представлена схема процесса сопряжения. В этом слу­чае энергодонорной реакцией является перенос электрона от первона­чального восстановленного переносчика (D_R) на следующий перенос­чик ЦЭТ (Ад), который перед электронным переносом был окислен.

Рис. 4.17. Схема процесса сопряжения в центре сопряжения

Эта схема работает, как для центров сопряжения ЦЭТ митохон­дрий, так и для ЦЭТ хлоропластов и фотосинтетических бактерий.

Ферменты, осуществляющие синтез АТР также идентичны во всех этих системах.

В 1962 году Шен и Шен (КНР) выполнили очень важный экспе­римент, изучая индуцируемое светом мембранное фосфорилирование в хлоропластах высших растений [56]. Освещение хлоропластов в от­сутствие субстратов фосфорилирования (ADP и PJ приводит к обра­зованию некоторого энергизованного соединения или состояния ж, которое способно обеспечить синтез АТР в темноте, после добавки ADP и Р_:. Такие же эксперименты с теми же результатами были неза­висимо (никто не читает китайских журналов) выполнены в США [57]. ж не может быть образовано при температурах ниже -13° С, хотя индуцированный электронный транспорт продолжается и при тем­пературах до -30° С. В отсутствие АТР и фосфата время жизни ж в темноте равно около 0,5-1 с при 20° С и 45 с при 0° С. Образова­ние ж сопровождается конформационными изменениями мембраны. Эти изменения, вероятно, являются вторичными процессами. Если ж образуется во время освещения, то в темноте после добавления суб­страта фосфорилирования может быть синтезировано до 30 молекул АТР в каждой ЦЭТ [56-58].

Таким образом, ясно, что в схему, показанную на рис. 4.17, мы должны включить ж, которую обычно называют энергизованным ин­термедиатом или первичным макроэргом (рис. 4.18).

Рис. 4.18. Схема процесса сопряжения в центре сопряжения с участием первичного макроэрга

Все гипотезы о возможных механизмах мембранного фосфорили­рования отличаются друг от друга предположениями о природе ж. Первая концепция была предложена Е. Слейтером в 1953 году. По Слейтеру, х — это некоторое «энергизованное химическое со­единение». После бесчисленных напрасных попыток обнаружить х, в 1961 году Митчелл и Вильямс независимо высказали идею о том, что образование АТР может происходить под действием протонов без какого-либо химического интермедиата [50, 60]. Эта очень плодотвор­ная идея дала сильный толчок развитию биоэнергетики за последние 35 лет. Между точками зрения Митчелла и Вильямса о роли протонов как макроэргов была, однако, большая разница^ Эта разница своди­лась не только к языку, использованному обоими авторами, но и имела принципиальное значение для истинного понимания механизма мем­бранного фосфорилирования. В своей «хемоосмотической» гипотезе Митчелл связывает протондвижущую силу с трансмембранной разни­цей электрохимических потенциалов, возникающих в водных фазах, разделенных мембраной. Включение в рассмотрение обширных водных фаз с необходимостью требует диссипации энергии, освобождаемой в ходе энергодонорного процесса (электронный транспорт) по все­му окружающему пространству. Отвергая эту точку зрения, Вильямс утверждает: «Протоны в мембранах, а не осмотический трансмем­бранный градиент протонов требуются для обеспечения синтеза АТР». Он говорит также об энергиях локальных зарядов, генерируемых при отделении протонов от электронов соответствующими реакциями.

В настоящее время ясно (мне, по крайней мере), что Вильямс был прав, а Митчелл ошибался.

Более того, эти два ученых отвечали, по существу, на разные во­просы. Подход Митчелла строго следовал обычной термодинамике. Он ответил на следующий вопрос: может ли в принципе перенос протонов вдоль градиента их электрохимического потенциала Д/х_н+ обеспечить энергоакцепторный процесс синтеза АТР? Ответ, конечно, да. Это термодинамически возможно, если Д^_н+ удовлетворяет условию:

где Д6? — возрастание свободной энергии Гиббса, требуемое для образования АТР из ADP и Р-. Митчелл — автор многих блестящих публикаций, относящихся к проблемам переноса ионов через био­логические мембраны. Его статьи фактически создали новую главу в биохимии живой клетки. Он был заслуженно удостоен Нобелевской премии. Однако в своих статьях, касающихся хемоосмотической кон­цепции, он ни разу не ответил и даже ни разу не задал единственный важный вопрос в этой проблеме: как может энергодонорная реакция переноса протона через мембрану быть прочно сопряжена с энергоак­цепторной реакцией образования АТР? Подход Митчелла в сущности сводит проблему к закону действующих масс, т. е. к схеме реакций, представленных в уравнениях (4.20) и (4.21), которая никогда не может привести к значительной эффективности.

С другой стороны, по Вильямсу, первичный макроэрг представляет собой локальный зарад, образованный при отрыве протона от электро­на в ходе соответствующей реакции. Возникновение такого протона на самом деле представляет собой образование неравновесного состоя­ния, определенного локального центра. Это согласуется с концепцией МакКлэйра о том, что сохраняемая энергия может выполнить работу только в ходе переноса к другой форме сохраняемой энергии.

Детальный анализ различи^ концепций Митчелла и Вильямса можно найти в монографиях [31,41]. Рассмотрим теперь образова­ние таких неравновесных состояний в электрон-транспортной цепи митохондрий и в ферменте АТРсинтазы.

Рис. 4.19. Схема ЦЭТ вблизи первого пункта сопряжения и положения уровней энергии восстановленных электронных переносчиков

На рис. 4.19 представлена ЦЭТ в первом комплексе Грина и даны положения уровней энергии электрона в восстановленных состояни­ях соответствующих электронных переносчиков. Можно видеть, что единственное существенное уменьшение энергии электронов имеет место при переходе от железосерного,центра N-2 к убихинону. Было доказано, что в первом пункте сопряжения митохондрий роль «пере­носчика-трансформатора» играет N-2 центр [61].

Рис. 4.20. Структуры активных центров биядерных и тетроядерных железосерных белков

На рис. 4.20 изображены структуры активных центров в биядер­ных и тетроядерных железосерных белках. 5)ти центры, как правило, содержат два или четыре атома железа. Каждый атом железа находит­ся в тетраэдрическом окружении серных ли гандов: два цистеиновых остатка соединяют железо с белком, а два атома неорганической се­ры образуют мостики между атомами железа. Железосерные центры являются одноэлектронными переносчиками. В окисленном, основ­ном, состоянии центр диамагнитен. Одноэлектронное восстановление превращает его в парамагнитный центр, который может быть зареги­стрирован методом ЭПР.

ЦЭТ митохондрий может находиться в нескольких состояниях [54,55]. Для нас важны сопряженные состояния 3 и 4. В состоянии 3 имеется избыток субстратов фосфорилирования и образование АТР не является лимитирующей стадией всего процесса. В состоянии 4

концентрация ADP очень мала и лимитирующей стадией скорости всего процесса сопряжения становится акт синтеза АТР.

Наиболее информативным методом изучения окисления и кон- формационных состояний железосерных белков является ЭПР. Этот метод был применен для регистрации неравновесного состояния цен­тра N-2 в первом комплексе Грина и его релаксации к равновесию.

Для биядерных центров действует модель обменного анти- ферромагнитного спинового взаимодействия. Согласно этой моде­ли, основное состояние восстано­

вленного центра имеет суммарный спин S = ^х!г. Неспаренный элек­трон делокализован между двумя ато­мами железа с обменным интегра­лом J < 0. Первый возбужденный спиновый уровень (5 = ³/>) лежит на А = 3|J| над основным уров­нем. В качестве первого приближе­ния можно считать, что это справед­ливо и для тетроядерных центров.

Спин-решеточная магнитная ре­лаксация (не путать с конформаци­онной релаксацией!) железосерных центров осуществляется по двухфон­ному механизму Орбаха (рис. 4.21).

Рис. 4.21. Механизм Орбаха спин-решеточной релаксации

Чтобы получить железосерный центр в неравновесном состоянии, был использован описанный выше метод низкотемпературного восста­новления термолизованными элек­тронами. Повышение температуры приводит к усилению внутримо­лекулярной подвижности и релаксации центра к равновесному состо­янию.

На рис. 4.22 представлен центр ЭПР митохондрий сердца быка при 20 К. Эта температура соответствует максимальной интенсивности сигналов ЭПР железосерных центров — см. ниже). Митохондрии были в восстановленном состоянии. Восстановителями служили эндогенные

Рис. 4.22. Механизм Орбаха спин-решеточной релаксации

субстраты при комнатной тем­пературе, так что все парамаг­нитные центры успевали релак­сировать. Две компоненты, обо­значенные стрелками, принад­лежат центру N-2. Их положе­ния (//-факторы) в неравновес­ном состоянии не изменяются. Однако температурные зависи­мости этих компонент чрезвы­чайно чувствительны к ничтож­ным структурным изменениям.

Поэтому для изучения не­равновесных состояний железо­серных центров, появляющихся в процессе электронного пере­носа, была использована так называемая техника кривых 1(Т) — «кривые зависимости интенсивности от температуры». На рис. 4.23 по­казана типичная кривая ЦТ) железосерного центра (в данном случае — восстановленного ферредоксина). В низкотемпературной области (1) интенсивность сигнала уменьшается с уменьшением температуры, бла­годаря эффектам насыщения микроволновой мощностью. В срединной части (2) выполняется закон Кюри (I = const/T). Отклонение от за­кона Кюри в высокотемпературной части (3), обусловлено уширением линии, являющейся следствием уменьшения времени спин-решеточ­ной релаксации. Положение кривой ЦТ) (особенно ее максимума) на оси Т является «отпечатком пальцев» структуры центра. Согласно механизму Орбаха, магнитная релаксация (и поэтому микроволновое насыщение) центра сигнала ЭПР, определяется значением обменно­го интеграла J (см. выше). Это значение, в свою очередь, зависит главным образом от расстояния между атомами железа и от значений S-Fe-S углов в железосерном центре (рис. 4.20).

На рис. 4.24 представлены кривые ЦТ) восстановленного центра N-2 митохондрий сердца быка, зарегистрированные в разных услови­ях. Наиболее интересные особенности этих данных могут быть вкрат­це сформулированы следующим образом. Кривая ЦТ) центра N-2

Рис. 4.23. Кривая 1(Т) сигна­ла ЭПР (компонента g_z) восста­новленного растворимого фер- редоксина гороха в равновес­ном состоянии: a — исход­ный препарат, б — слегка кон­формационно измененный по­сле добавки 0,8 М NaCl

восстановленного NADH сопряженных митохондрий в состоянии 4, совпадает с кривой J(T) неравновесного центра N-2 в разобщен­ных митохондриях, полученных восстановлением термолизованными электронами в замкнутой матрице.

Рис. 4.24. Кривые 1(Т) восстановленно­го N-2 центра митохондрий сердца быка: (1о) — разобщенные митохондрии, восста­новленные термолизованными электронами при 77 К; (2*) — тот же препарат после ре­лаксации при 210 К; (1а) — активные фос- форилирующие митохондрии в состоянии 4. Недостаточно ADP, и скорость электронного транспорта определяется скоростью фосфо­рилирования ADP; (2 ж) — тот же препарат после разобщения методом оттаивания и за­мораживания

В третьем состоянии кривая ЦТ) совпадает с кривой равновесного центра N-2 в разобщенных митохондриях. Такая же кривая ЦТ) может быть получена и у сопряженных митохондрий, если заблокировать ротеноном перенос электрона между N-2 и UQ (рйс. 4.19).

Чтобы понять значение этих данных, полезно рассмотреть измене­ния энергии электрона на его пути через первый комплекс Грина (4.19). Перенос электрона через ряд переносчиков от NADH до N -2 не сопро­вождается изменением его энергии. Следующий акт, восстановление UQ, может произойти только после понижения энергии неравновесно­го восстановленного центра N-2 в ходе конформационной релаксации. Анализ лимитирующих стадий дыхательного электронного транспор­та, проведенный во многих лабораториях с различными субстратами (наиболее важные результаты были получены в лаборатории Б. Чан­са [41,61]), показали, что в четвертом дыхательном состоянии перенос электрона от NADH к UQ замедляется на 30-50 мс по сравнению с третьим дыхательным состоянием (избыток ADP).

Таким образом, перенос электрона от NADH к N-2 не являет­ся лимитирующей стадией процесса электронного переноса от NADH к UQ. Эксперименты с ротеноном показали, что во время прямого элек­тронного переноса конечное состояние центра N-2 равновесно. Это значит, что в этом случае неравновесное восстановленное состояние N-2, образованное после присоединения электрона к равновесному окисленному центру, переходит в равновесное состояние. Более того, это также значит, что перенос электрона от N-2 (после релаксации) к следующему акцептору (UQ) тоже не является лимитирующей ста­дией. Замедление электронного транспорта в четвертом дыхательном состоянии вызвано, таким образом, возрастанием времени перехода восстановленного неравновесного центра N-2 в равновесное состо­яние. Это может быть связано либо с временем жизни центра N-2 в неравновесном состоянии, либо с длительностью конформацион­ной релаксации. Неравновесный восстановленный центр N-2 был зарегистрирован в митохондриях в четвертом дыхательном состоянии. Поэтому можно сделать вывод, что лимитирующей стадией является первая из перечисленных выше, т.е. время жизни N-2 в неравновес­ном восстановленном состоянии. Следует напомнить, что в четвертом дыхательном состоянии электронный транспорт происходит гораздо медленнее, чем в третьем, и что в нативных прочно сопряженных митохондриях синтез АТР практически прекращается [62]. Отсюда следует, что в этих условиях перенос электрона через пункт сопряже­ния и, следовательно, релаксация центра N-2 в равновесное состояние не может происходить без фосфорилирования АЕ)Р.

Энергия, освобождаемая при окислении NADH, сохраняется в конформационно неравновесной форме N-2 и может быть затем использован для фосфорилирования ADP АТРсинтазой.

4.9.