6.2. ИССЛЕДОВАНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ МЕМБРАНОСВЯЗАННЫХ ФЕРМЕНТОВ В НОРМЕ И ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ

Для исследования отдельных свойств нативных мембран кле­ток, а также для изучения молекулярных механизмов регулиро­вания метаболических процессов, осуществляющихся с участи­ем мембранных компонентов клетки, используются различные физико-химические методы модификации мембран.

Химические способы модификации мембранных структур свя­заны с использованием естественных и синтетических соедине­ний. К группе естественных модифицирующих агентов, изменя­ющих липидный состав мембран в нативной клетке, относятся липидпереносящие белки, ферменты обмена фосфолипидов — фосфолипазы, диметилазы, системы обмена холестерина. Они регулируют микровязкость и подвижность мембранных компо­нентов, которые являются важнейшими факторами поддержа­ния нормальной структурно-функциональной организации и обес­печения взаимодействия мембран.

Синтетические биологически активные вещества используют для индукции проницаемости природных и искусственных мем­бран. К ним относятся ионофоры (валиномицин, обеспечиваю­щий проникновение ионов калия через мембрану; крауны — мак- роциклические полиэфиры, обеспечивающие проницаемость мем­бран для ионов натрия, кальция, магния) и каналообразователи (например, аламетицин, способствующий проникновению через мембрану АТР).

К физическим методам модификации липидных и белковых компонентов биомембран относят ионизирующее и УФ-излуче­ние, температуру.

Лабораторная работа № 4

Определение функциональной активности ацетилхолинэстеразы эритроцитарных мембран

Метод Хестрина основан на колориметрическом определении концентрации ацетилхолина. Его чувствительность составляет 5 мкг ацетилхолина. Ошибка определения ±1 %. Достоинство это­го метода при определении активности АХЭ состоит в том, что он позволяет исследовать кинетику ферментативной реакции при различных условиях, позволяет работать в широком интервале концентраций субстрата, производить массовые определения, удо­бен для регистрации активности АХЭ различного происхожде­ния в стандартных условиях (определенные концентрации фер­мента и субстрата, стандартное время реакции при условии со­блюдения нулевого порядка).

Принцип метода: при взаимодействии ацетилхолина с ще­лочным раствором гидроксиламинхлорида образуется ацетил- гидроксамовая кислота, которая в кислом растворе дает с хлор­ным железом цветную реакцию:

(CH₃)N⁺CH₂CH₂OC(O)CH_g + NH₂OH = (CH₃)₃N⁴CH₂CH₂OH +

+ CH₃C(O)NHOH

Материалы и оборудование: 2 моль/л раствор солянокисло­го гидроксиламина, 10 %-ный раствор хлорного железа, приго­товленный на 0,1 моль/л растворе соляной кислоты, 3,5 моль/л раствор гидроксида натрия, 0,1 моль/л раствор соляной кисло­ты, ацетилхолинхлорид, фотоэлектроколориметр КФК-3 или спектрофотометр СФ-46, кровь доноров, стеклянные пробирки, пипетки, фильтровальная бумага.

Ход работы

Предварительно выделить мембраны эритроцитов из крови согласно методике, описанной в лабораторной работе № 1.

Для построения калибровочного графика необходимо приго­товить растворы ацетилхолинхлорида с концентрациями 0,1; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5; 4,0 ммоль/л ацетилхолинхлорида. Оп­ределить оптическую плотность этих растворов против раствора сравнения (последовательность операций см. ниже). Построить калибровочный график, где по оси ординат отложена оптичес­кая плотность растворов ацетилхолинхлорида, а по оси абсцисс — концентрация этого вещества. В пределах указанных концент­раций ацетилхолина калибровочная прямая должна подчинять­ся закону Бугера—Ламберта—Бера.

Для приготовления раствора сравнения в пробирку налить реактивы в такой последовательности: 2 мл раствора хлорного железа, 2 мл соляной кислоты, 1 мл щелочного гидроксиламина, 1 мл 2,5 ммоль/л раствора ацетилхолинхлорида и 1 мл дистил­лированной воды. Цвет смеси должен быть лимонно-желтым.

В контрольную и опытную пробирки налить соответственно по 1 мл бидистиллированной воды и суспензии мембран эрит­роцитов. Затем добавить в них по 2 и 2,5 ммоль/л раствора ацетилхолинхлорида и поместить пробирки в термостат при 37 °С на 15 мин.

Лабораторная работа № 5

Исследование УФ-нидуцированных изменений функциональной активности ацетилхолинэстеразы эритроцитарных мембран

Материалы, и оборудование: 2 моль/л раствор солянокисло­го гидроксиламина, 10 %-ный раствор хлорного железа, приго­товленный на 0,1 моль/л растворе соляной кислоты, 3,5 моль/л раствор гидроксида натрия, 0,1 моль/л раствор соляной кисло­ты, ацетилхолинхлорид, фотоэлектроколориметр КФК-3 или спектрофотометр СФ-46, установка для УФ-облучения, кровь до­норов, стеклянные пробирки, пипетки, фильтровальная бумага.

Ход работы

Предварительно выделить мембраны эритроцитов из крови согласно методике, описанной в лабораторной работе № 1.

Один объем (3 мл) суспензии мембран эритроцитов использо­вать в качестве контрольного образца и разлить по трем пробир­кам, второй (9 мл) — разделить на три части (по 3 мл) и подвер­гнуть воздействию. УФ-света в дозах 0,75; 2,27; 3,78 кДж/м² при помощи установки для ультрафиолетового облучения биоси­стем, которая подробно описана в учебном пособии В. Г. Артю­хова, О. В. Путинцевой (1996). Облучение суспензии мембран эрит­роцитов в трис-HCl буферном растворе (pH 7,6) проводят в стек­лянной термостатируемой кювете (20±1 °С) при постоянном пе­ремешивании с помощью магнитной мешалки излучением лам­пы типа ДРТ-400 через светофильтр УФС-1 (с полосой пропуска­ния 240—390 нм).

Таблица 19

Ферментативная активность ацетилхолинэстеразы мембран эритроцитов человека до и после УФ-облучения

Сделать вывод о степени и характере изменений функцио­нальной активности ацетилхолинэстеразы эритроцитарных мем­бран, модифицированных воздействием УФ-света в различных дозах. Какие процессы, протекающие при УФ-облучении эритро­цитарных мембран, обусловливают изменения каталитической ак­тивности мембраносвязанной АХЭ? Какова зависимость фермен­тативной активности АХЭ эритроцитарных мембран от дозы УФ- облучения?

Лабораторная работа № 6

Исследование ферментативной активности свободной и мембраносвязанной ацетилхолинэстеразы в интактном состоянии и после УФ-облучения

Материалы и оборудование: 2 моль/л раствор солянокисло­го гидроксиламина, 10 %-ный раствор хлорного железа, приго­товленный на 0,1 моль/л растворе соляной кислоты, 3,5 моль/л раствор гидроксида натрия, 0,1 моль/л раствор соляной кисло­ты, ацетилхолинхлорид, фотоэлектроколориметр КФК-3 или спектрофотометр СФ-46, установка для УФ-облучения, кровь до­норов, готовый препарат ацетилхолинэстеразы из эритроцитов быка, стеклянные пробирки, пипетки, фильтровальная бумага.

Ход работы

Предварительно выделить мембраны эритроцитов из крови согласно методике, описанной в лабораторной работе № 1. Ис­пользуя описание методики в лабораторной работе № 5, провести определение каталитической активности АХЭ эритроцитарных мембран в норме и при воздействии УФ-излучения в дозах 1,5; 3,0; 4,5 кДж/м². Данные занести в таблицу, аналогичную табл. 19. Те же эксперименты провести с буферными растворами свобод­ной ацетилхолинэстеразы (10"^а моль/л). Оформить табл. 19 для фермента в свободном состоянии. Результаты представить в виде графика, где по оси абсцисс отложены величины доз УФ-света, а по оси ординат — значения активности АХЭ, выраженные в про­центах от уровня контрольного образца, для свободного (кривая 1) и мембраносвязанного (кривая 2) фермента. Сделать вывод об уровне фоточувствительности разных форм фермента. Чем мо­гут быть обусловлены различия в характере УФ-индуцирован­ных изменений функциональной активности свободной и свя­занной АХЭ?

Лабораторная работа № 7

Определение функциональной активности ацетилхолин­эстеразы эритроцитарных мембран после индукции пероксидного окисления липидов

Мембранные ферменты изменяют свою активность под влия­нием продуктов ПОЛ, что может быть обусловлено образовани­ем комплекса окисленный липид — белок, ассоциацией белко-

вых молекул и разрушением аминокислот, в частности, содер­жащих SH-группы.

Цель работы — выявление изменений функциональной ак­тивности АХЭ эритроцитарных мембран после индукции аскор- батзависимого пероксидного окисления липидов. Ионы Fe²⁺ ока­зывают каталитическое действие на образование пероксидов. При этом Fe²⁺ окисляется до Fe³⁺, а функция аскорбиновой кислоты заключается в регенерации ионов за счет обратного восстановле­ния Fe³⁺ до Fe²⁺.

Материалы, и оборудование: 2 моль/л раствор солянокисло­го гидроксиламина, 10 %-ный раствор хлорного железа, приго­товленный на 0,1 моль/л растворе соляной кислоты, 3,5 моль/л раствор гидроксида натрия, 0,1 моль/л раствор соляной кисло­ты, ацетилхолинхлорид, сульфат железа FeSO₄, аскорбиновая кис­лота, фотоэлектроколориметр КФК-3 или спектрофотометр СФ- 46, кровь доноров, стеклянные пробирки, пипетки, фильтроваль­ная бумага.

Ход работы

Выделить эритроцитарные мембраны по методике, описанной в лабораторной работе № 1. К 1 мл суспензии эритроцитарных мембран добавить 150 мкл смеси растворов FeSO₄ (100 мкмоль/л) и аскорбиновой кислоты (2 ммоль/л) и инкубировать 5, 15, 30, 45 и 60 мин при 37 “С. Затем провести определение ферментативной активности АХЭ нативных и модифицированных мембран. Па­раллельно исследовать уровень ТБК-реактивных продуктов пе­роксидного окисления липидов (см. лабораторную работу № 11). После завершения экспериментов сопоставить динамику изме­нений величин активности АХЭ в процессе развития ПОЛ эрит­роцитарных мембран и уровня накопленных окисленных про­дуктов липидов.

Лабораторная работа № 8

Исследование функциональной активности мембраносвязанной Na⁺, К⁺-АТФазы

Распространенные методы изучения функциональной актив­ности Na⁺, К^н-АТФазы основаны на определении количества не­органического фосфата, содержащегося в исследуемом растворе. Существуют различные методы обнаружения фосфата в биообъ­ектах. Но все они основаны на том, что в кислой среде молибде-

16. Заказ 3788

241

новокислый аммоний и фосфорная кислота (ее соли) взаимодей­ствуют между собой с образованием фосфомолибдата аммония, восстановление которого приводит к образованию смеси различ­ных оксидов молибдена, имеющих синий цвет. Появившаяся ок­раска устойчива в течение 1—2 ч. Для ее стабилизации применя­ют CuSO₄. Различные методы отличаются природой восстанови­теля и кислотностью среды, что определяет скорость реакции и чувствительность метода.

Материалы и оборудование: хлорид натрия, хлорид калия, хлорид магния, строфантин, ЭДТА, АТР, трис-HCl буфер (pH 7,4), трихлоруксусная кислота, термостат, аскорбиновая кислота, мо­либдат аммония, однозамещенный фосфат калия, фотоэлектро­колориметр КФК-3 или спектрофотометр СФ-46, кровь доноров, стеклянные пробирки, пипетки, фильтровальная бумага.

Ход работы

Получить препарат мембран эритроцитов по методике, опи­санной в лабораторной работе № 1. В пробирки для определения общей АТФазной и Mg²^-АТФазной активности внести по 1 мл суспензии мембран. В контрольные пробы вместо мембран вне­сти 1 мл трис-HCl буфера. Добавить в пробирки для определения М£²⁺-АТФазной активности по 0,3 мл строфантина (0,025 %), в контрольные и опытные пробирки для определения общей АТФазной активности - по 0,3 мл буфера, перемешать и через 30 мин в каждую пробирку внести по 1 мл инкубационной сре­ды. Она содержит: 100 ммоль/л NaCl, 10 ммоль/л КС1, 3 ммоль/л MgCl₂, 1 ммоль/л ЭДТА, 5 ммоль/л АТР, 50 ммоль/л трис-НО буфер (pH 7,4). Далее термостатировать содержимое пробирки в течение 1 ч при 37 °С. Реакцию остановить добавлением 0,5 мл 20 %-ной трихлоруксусной кислоты. Белок удалить центрифу­гированием при 5000 об/мин в течение 10 мин.

Количество образующегося фосфата определяют по методу с применением аскорбиновой кислотой, который включает исполь­зование следующих реактивов:

а) аскорбиновая кислота —- 10 %-ный раствор;

б) молибдат аммония — 0,42 %-ный раствор, приготовлен­ный на 1 н серной кислоте;

в) смесь, состоящая из одного объема раствора (а) и шести объемов раствора (б). Готовится непосредственно перед работой и хранится в течение дня в ледяной бане.

К 0,9 мл исследуемого раствора, содержащего 0,03 — 0,2 мкмоль неорганического фосфата, добавить 2,1 мл реактива (в). Перемешать и инкубировать 20 минут при 45 °С или 60 мин при 37 °С. После охлаждения измерить величину оптической плотности при 620 нм против контрольной пробы, содержащей вместо исследуемого раствора бидистиллированную воду. По раз­нице между полученными значениями общей АТФазной и Mg²⁺- АТФазной активности найти активность Na⁺, К⁺-АТФазы эрит­роцитарных мембран с помощью калибровочного графика.

Для построения калибровочной прямой в пробирки налить по 0,15; 0,30; 0,50; 0,70 и 0,90 мл стандартного раствора неоргани­ческого фосфата, содержащего 0,23 мкмоль/л фосфата (КН₂РО₄) в 1 мл. Довести объем в каждой пробирке до 1 мл бидистиллиро­ванной водой и далее обрабатывать, как указано выше. Зарегист­рировать оптическую плотность проб и полученные данные изоб­разить графически, откладывая по оси абсцисс содержание фосфа­та в пробе, а по оси ординат — оптическую плотность при 620 нм.

Активность фермента рассчитывают по формуле:

_л_ДОобщ -ДРм_е)-Ю^{б в} Kjt-31

где АВ_о6щ = П_о6щ- D_k — разность величин оптической плотности раствора для определения общей АТФазной активности и конт­рольного раствора; AD_Mg = D_Mg - D_K — разность величин оптичес­кой плотности раствора для определения М§²⁺-АТФазной актив­ности и контрольного раствора; К — калибровочный коэффици­ент, определяемый по формуле: К = — (D в абсолютных величи-

с

нах для определенной концентрации, с — значение концентра­ции); j — количество белка в пробе; t — время инкубации (мин); 31 — молекулярная масса фосфора.

Активность Na⁺, К⁺-АТФазы выражают в нмоль Р_п/мг (белка) в мин или в мкмоль/л Р_л/мл теней в час.

Лабораторная работа № 9

Изучение УФ-индуцированных изменений функциональ­ных свойств Na⁺, К⁺-АТФазы эритроцитарных мембран

Материалы, и оборудование: хлорид натрия, хлорид калия, хлорид магния, строфантин, ЭДТА, АТР, трис-HCl буфер (pH 7,4), трихлоруксусная кислота, термостат, аскорбиновая кислота, мо­либдат аммония, однозамещенный фосфат калия, сульфат желе­за, фотоэлектроколориметр КФК-3 или спектрофотометр СФ-46, установка для УФ-облучения биообъектов, кровь доноров, стек­лянные пробирки, пипетки, фильтровальная бумага.

Ход работы

Предварительно выделить мембраны эритроцитов из крови согласно методике, описанной в лабораторной работе № 1.

Один объем (3 мл) суспензии мембран эритроцитов использо­вать в качестве контрольного образца и разлить по трем пробир­кам, второй (9 мл) — разделить на три части (по 3 мл) и подвер­гнуть воздействию УФ-света в дозах 0,75; 2,27; 3,78 кДж/м² при помощи установки для ультрафиолетового облучения биосистем. Облучение суспензии мембран эритроцитов в трис-HCl буферном растворе (pH 7,6) проводят в стеклянной термостатируемой кю­вете (20±1 °С) при постоянном перемешивании с помощью маг­нитной мешалки излучением лампы типа ДРТ-400 через свето­фильтр УФС-1. Затем следует определить каталитическую ак­тивность Na⁺, К⁺-АТФазы в контрольных и опытных (при всех дозах облучения) пробирках по методике, описанной в лабора­торной работе № 8. Данные занести в табл. 20.

Таблица 20

Ферментативная активность Na*, N-АТФазы. мембран эритроцитов человека после УФ-облучения

Сделать вывод о характере изменений функциональной ак­тивности Na⁺, К^-АТФазы эритроцитарных мембран, модифици­рованных воздействием УФ-света в различных дозах. Какие про­цессы, протекающие при УФ-облучении эритроцитарных мемб-

ран, обусловливают изменения каталитической активности мем­браносвязанной АТФазы? Какова зависимость ферментативной активности Na⁺, К⁺-АТФазы эритроцитарных мембран от дозы УФ-облучения?

Лабораторная работа № 10

Определение ферментативной активности Na⁺, К⁺-АТФазы эритроцитарных мембран после индукции пероксидного окисления липидов

Материалы и оборудование: хлорид натрия, хлорид калия, хлорид магния, строфантин, ЭДТА, АТР, трис-HCl буфер (pH 7,4), трихлоруксусная кислота, термостат, аскорбиновая кислота, мо­либдат аммония, однозамещенный фосфат калия, фотоэлектро­колориметр КФК-3 или спектрофотометр СФ-46, кровь доноров, стеклянные пробирки, пипетки, фильтровальная бумага.

Ход работы

Выделить эритроцитарные мембраны но методике, описан­ной в лабораторной работе № 1. К 1 мл суспензии эритроцитар­ных мембран добавить 150 мкл смеси растворов FeSO_d (100 мкмоль/л) и аскорбиновой кислоты (2 ммоль/л) и инкуби­ровать 5, 15, 30, 45 и 90 мин при 37 °С. Затем провести определе­ние ферментативной активности Na⁺, К⁺-АТФазы нативных и мо­дифицированных мембран. Параллельно исследовать уровень ТБК-реактивных продуктов пероксидного окисления липидов (см. лабораторную работу № 11). После завершения экспериментов сопоставить динамику изменений величин активности Na⁺, К⁺-АТФазы в процессе развития ПОЛ эритроцитарных мембран и уровня накопленных окисленных продуктов липидов.

6.3.