4.10. Стационарное мембранное фосфорил и рование

До сих пор речь шла о механизме «элементарного акта» синтеза АТР Величина трансмембранного Дд_н+ не имеет никакого отно­шения к элементарному акту. Этот градиент непрерывно поставляет ионы водорода для повторяющихся «ударов», реализуя, таким образом, возникновение неравновесных состояний и их последующую конфор­мационную релаксацию.

В монографии [31] была предложена следующая упрощенная схе­ма циклической работы АТРсинтазы (рис. 4.28). Эта схема объясняет

многократное образование АТР после создания разницы pH по обе сто­роны мембраны везикул, содержащих факторы F,, доступные внешней водной среде. Кстати, градиент Дд_н в некоторых условиях включает

Рис. 4 28. Схема циклического функционирования АТРсинтазы

не только ДрН, но и ірадиент трансмембранного электриче­ского потенциала Д0. Ана­лиз приводит в этом случае к тому же выводу. Д за­висит от распределения заря­дов вблизи активного центра и определяет величину рК ки­слотных групп. Пересечение уровня pH при быстром умень­шении рК во время конформа­ционной релаксации приведет к тому же эффекту, что и пе­ресечение уровня рК при бы­стром повышении pH

На схеме рис. 4.28 мы рассмотрели только один центр, связы­вающий АТР и ADP с двумя протон акцепторными группами А~ и В . Присоединение ADP и выброс АТР в водную фазу играет роль «переключателя», который попеременно осуществляет контакт F, то с внутренней (кислой), то с внешней («щелочной») водными фаза­ми Различные положения переключателя символизируют возможность протонных групп А и В контактировать с внутренней и с внешней средой. Это показано на рис 4.27 в виде двух клапанов anb. Клапан а осуществляет контакт функциональной кислотной группы с внутрен­ним объемом везикулы, а b — с внешней средой. Открытое положе­ние а с закрытым положением Ь (состояние 1) указывают, что средняя скорость протонирования А " и В’ из внутреннего пула протонов согласуются с соответствующими скоростями диссоциации протонов из АН и ВН во внешнюю среду Перекрытие а может быть вызвано присоединением субстратов фосфорилирования, в то время как их удаление из F, обеспечивает контакт А' и В“ с внутренней областью везикулы (клапан а открыт).

связывание АТР или ADP с активным центром F_t хлоропластов бло­кирует выход протонов из тилакоида через канал F_o [71,72].

Рассмотрим теперь последовательность событий во время функ­ционирования АТРсинтазы, связанной с мембраной, при наличии трансмембранной разности pH. Положение 1 на рис. 4.27 соответствует квазиравновесному состоянию фермента: нет субстратов фосфори­лирования в активном центре, функциональные кислотные группы протонированы, благодаря их контакту с «кислым» внутренним объ­емом везикулы (pH,- < рК_а), а открыт. Быстрая утечка протонов во внешнюю водную фазу через АТРсинтазу предотвращается барье­ром, запрещающим контакт АН группы с внешней средой (клапан b закрыт). Присоединение субстратов фосфорилирования к активному центру Fj (переход 1 —► 2) делает возможными два события:

1. Бесплатное превращение ADP и Р, в прочно связанную АТР

(переход 2 —> 3).

2. Блокирование пути протона через а (клапан а закрыт).

Таким образом, после связывания субстратов группа АН диссоци­ирует, и становится возможным выход протонов в «щелочную» водную фазу (рК_а < рН₀, клапан b открыт — переход 3 —► 4) в соответствии с хорошо известными экспериментальными фактами [71,72]: про­цесс фосфорилирования ADP ускоряет выход протонов через F_o. Эта модель предполагает, что связывание субстратов стимулирует выход протонов во внешнюю среду. В неравновесном состоянии 4 фермент содержит прочно связанную молекулу АТР. Состояние 4 энергетически невыгодно из-за избытка отрицательных зарядов в белковой глобуле. В ходе последующей релаксации фермента молекула АТР отщепляется от F, во внешнюю водную фазу. Таким образом, фермент достигает состояния 5: а открыт, b закрыт. После последующего протонирова­ния кислотных групп (переход 5 —> 1) цикл будет повторяться, пока выполняются условия: pH, < рК_а < рН₀.

Попробуем теперь ответить на важный, хотя скорее риторический вопрос: что является движущей силой образования АТР в ходе мем­бранного фосфорилирования? Обычный ответ в почти любой публи­кации, касающейся этой проблемы, таков: ДрН (Д^_н+) между двумя сторонами мембраны. Этот ответ ошибочен. Разность концентраций и кинетической энергии протонов являются тепловыми составляющи­ми полной внутренней энергии системы (терминология МакКлэйра) и не могут быть использованы для совершения работы. Должно при­сутствовать механическое устройство для преобразования теплового компонента в сохраняемый. Повторим еще раз, что на молекуляр­ном уровне механические и электрические силы неразличимы [32]. В настоящее время конструкция и способ работы этого устройства известны.

4.10.