ВЫДЕЛЕНИЕ И РАЗДЕЛЕНИЕ МЕМБРАН

Выделению мембран предшествует этап разрушения клеток и тканей. Для этого подбирают методику, позволяющую не толь­ко эффективно разрушать клетки, но и сохранять нативную струк­туру мембран, подлежащих выделению.

С целью облегчения последующего разрушения растительных, грибных и бактериальных клеток их сначала обрабатывают фер­ментами, расщепляющими компоненты клеточной стенки (лизо­цим, целлюлаза). Более жесткая обработка клеток предусматри­вает их растирание с помощью абразивных материалов (стеклян­ных шариков, песка, оксида алюминия), разрушение ультразву­ком и путем экструзии (продавливание суспензии клеток через отверстия под давлением). Полученный гомогенат клеток проце­живают и используют дальше для получения мембран.

Чаще всего для разделения мембран применяют метод цент­рифугирования. Мембранные частицы разделяют по скорости их седиментации (зональное центрифугирование) или по плавучей плотности (изопикническое центрифугирование). Коэффициент седиментации (S) определяется по формуле:

S = v/w2r = m(l - Vp)/f,

где v — скорость движения частицы; w — угловая скорость вра­щения ротора; г — расстояние до центра вращения; m — масса частицы; f — коэффициент трения; р — плотность растворителя; V — парциальный удельный объем частицы (равный увеличе­нию объема, вызываемого прибавлением единицы массы раство­ряемого вещества к раствору).

Величина коэффициента седиментации зависит от несколь­ких факторов: концентрации раствора, скорости движения час­тиц, заряда, формы и массы частиц. Введено понятие стандартно­го значения константы седиментации, определяемое в системе, имеющей вязкость и плотность воды при +20 °С (S°_o).

Для выделения различных мембранных структур из гомоге­ната, имеющих разные величины коэффициента седиментации, применяют зональное центрифугирование в градиенте плотнос­ти определенных веществ. Исследуемый раствор наносят на пред­варительно приготовленный в центрифужной пробирке гради­ент плотности и центрифугируют. Градиент создается путем по­следовательного наслоения растворов градиентной среды умень­шающейся концентрации (плотности) в центрифужной пробир­ке. Субклеточные структуры разделяются на отдельные зоны в соответствии с их относительной плотностью. Для создания гра­диента плотности необходимо подбирать вещества в чистом со­стоянии, не взаимодействующие с компонентами суспензии и реагентами исследуемого раствора. Чаще всего для этого исполь­зуют сахарозу, однако ее растворы с высокой концентарцией имеют большую вязкость, вследствие чего происходит дегидра­тация органелл или их лизис. Кроме того, серьезным недостат­ком этого метода является проницаемость многих органелл для сахарозы, что вызывает их осмотическое разрушение и измене­ние эффективной плотности. Поэтому в настоящее время для создания градиента плотности предпочитают применять другие среды: фиколл, перколл и др. (табл. 16).

Основные компоненты клетки осаждают в такой последова­тельности: целые клетки и их фрагменты, ядра, митохондрии, лизосомы, микротельца, микросомы (фрагменты эндоплазмати­ческой сети и плазматических мембран), отдельные типы мемб­ранных структур.

Таблица 16

Характеристика некоторых градиентных сред для выделения мембранных компонентов методом центрифугирования

Необходимо отметить, что получаемые при разрушении кле­ток мембранные фрагменты способны самопроизвольно образо­вывать замкнутые пузырьки — везикулы.

' Следует подчеркнуть, что препаративные типы центрифуг при­меняют для получения и очистки клеточных органелл или макро­молекул, т. е. чистых фракций (препаратов). Аналитические цент­рифуги позволяют анализировать распределение веществ в про­бирке в течение всего опыта. Поэтому они снабжены оптической системой (пхлиреновской, интерференционной, абсорбционной).

Для выделения мембран из клеточных гомогенатов использу­ют и другие методы: хроматографию, электрофорез, адсорбцию.

Распределительная хроматография основана на различиях в распределении разделяемых веществ между двумя фазами: под­вижной (растворитель) и неподвижной (сорбент). Ее разновидно­стями являются хроматография на бумаге, тонкослойная, коло­ночная, газожидкостная. Большой разрешающей способностью характеризуется тонкослойная хроматография: она позволяет об­наружить 1 нмоль вещества. Слой сорбента (толщина до 0,5 мм) готовится из силикагеля, оксида алюминия, целлюлозы. При этом обеспечивается низкое отношение массы растворенного вещества к массе сорбента (до 1/10⁸) и большое отношение поверхности к объему. Разрешающая способность метода колоночной хромато­графии на несколько порядков ниже, чем для тонкослойной, так как отношение массы растворенных веществ к массе сорбента равно 1/50.

Адсорбционная хроматография основывается на различной способности молекул смеси адсорбироваться на поверхности но­сителя (силикагель, окись алюминия, активированный уголь) при пропускании через него подвижной фазы. Принцип метода ионообменной хроматографии — разновидности адсорбционной хроматографии — заключается в способности ионообменника (от­рицательно заряженного катионита или положительно заряжен­ного анионита) обратимо адсорбировать заряженные молекулы при определенных значениях pH.

Гелъпроникающая хроматография успешно применяется для разделения и очистки мембранных белков-ферментов, так как позволяет фракционировать вещества в широких диапазонах pH, температуры, ионной силы без адсорбции на носителе молекул разделяемых соединений. Метод основан на принципе обратного молекулярного сита: более крупные молекулы быстрее проходят через слой мелких частиц носителя, а более мелкие (с диаметром меньше или равным диаметру пор в частице) — медленнее, так как диффундируют через поры инертного материала. В качестве молекулярных сит используют декстрановые, агарозные и поли­акриламидные гели. Преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет не только разделять, но и очищать и кон­центрировать макромолекулы (например, при добавлении к ис­следуемому раствору сухих гранул геля с диаметром пор мень­ше, чем диаметр молекул).

Для выделения различных мембранных структур использу­ется и аффинная хроматография. Принцип этого метода заклю­чается в способности выделяемого вещества’ специфически свя­зываться с лигандом, “пришитым” к нерастворимому носителю, при пропускании раствора через матрицу. В качестве последней применяют сефарозы (агарозные гели), активируемые путем свя­зывания различных лигандов: кофакторов, ингибиторов, субстра­тов мембранных белков-ферментов, лектинов в случае выделе­ния гликопротеинов; гормонов, бромциана, конканавалина А — соответственно при получении мембран, антител или целых кле­ток. Элюирование исследуемого вещества осуществляют в усло­виях диссоциации комплекса лиганд — вещество и сохранения нативной структуры выделяемого соединения.

Заряженные компоненты биомембран разделяют методом электрофореза по скорости их движения в электрическом поле, которая зависит от величины заряда, молекулярной массы и фор­мы молекул. Максимальное разделение макромолекул (в частно­сти, мембранных белков) обеспечивается при использовании ме­тода диск-электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ).

Разновидность электрофореза — изоэлектрическое фокуси­рование. Метод основан на электрофоретическом разделении сме­си белков в градиенте pH с достижением изоэлектрической точ­ки (ИЭТ) каждого белка и его “фокусированием” в отдельной зоне и применяется для быстрого и эффективного фракциониро­вания больших количеств (несколько граммов) образца на на­чальных стадиях его очистки.

5.3.