ОЦЕНКА ЧИСТОТЫ МЕМБРАННЫХ ФРАКЦИЙ
Наиболее часто для оценки чистоты выделенных мембранных фракций используют методы исследования удельной активности ферментов, называемых маркерами. Маркерные ферменты должны быть локализованы в определенном типе мембранных структур и катализировать реакции, соответствующие специфическим функциям этих мембран.
Кроме того, фермент можно использовать как маркер, если он прочно связан с мембраной и не подвергается активации или ингибированию при разделении мембранных фракций (табл. 17), Активность маркерных фермен-Таблица 17
Биохимические маркеры,
используемые для контроля чистоты мембранных фракций
| Мембранная фракция | Маркерный фермент |
| Плазматические мембраны | б'-Нуклеотидаза (КФ 3.1.3.б) Щелочная фосфатаза (КФ 3.1.3.1) Аденилатциклаза (КФ 4.6.1.1) Na+, К+-АТФаза(КФ 3.6.1.3) |
| Ядра | NAD-пирофосфорилаза (КФ 2.7.7.1) |
| Эндоплазматическая сеть | Глюкозо-6-фосфатаза (КФ 3.1.3.10) |
| Микросомы | NADPH-дегидрогеназа (КФ 1.2.1.16) |
| Пероксисомы | Каталаза (КФ 1.11.1.6) |
| Лизосомы | Кислая РНКаза (КФ 3.1.4.8) Кислая фосфатаза (КФ 3.1.3.2) |
| Саркоплазматический ретикулум | Са2+АТФаза (КФ 3.6.3.3) |
| Митохондрии: наружная мембрана внутренняя мембран | Моноаминооксидаза (КФ 1.4.3.4) Цитохромоксидаза (КФ 1.9.3.1) Цитохром-с-редуктаза (КФ 1.6.9.3) |
| Цитозоль | Лактатдегидрогеназа (КФ 1.1.1.27) |
тов контролируют на каждом этапе выделения и разделения мембран в исходном гомогенате и в каждой фракции с целью определения стадии осаждения и выхода исследуемых мембранных структур, а также потерь мембранных фракций. Гомогенность выделенного препарата мембран анализируют на основании увеличения активности маркерного фермента (-ов) в нем по сравнению с исходным гомогенатом клеток.
Часто используют не один, а два-три мембранных маркера. Однако необходимо помнить, что и мембраны одного типа способны проявлять гетерогенность, связанную с асимметрией белкового, липидного и углеводного состава мембран, в результате чего фермент может находиться в латентной форме из-за нарушения ориентации мембраны и недоступности активного центра для субстрата, например, в обращенных мембранных везикулах. Наиболее легко из внутриклеточных органелл идентифицируют митохондрии и ядра, затем — лизосомы и пероксисомы, наиболее трудно — плазматические мембраны и мембраны эндоплазматической сети. Сложность разделения последних обусловлена близостью величин диапазона плотностей этих структур, поэтому разделение по скорости седиментации осуществляется в том случае, если плазматические мембраны представлены крупными фрагментами.С целью преодоления недостатков вышеуказанного метода для оценки чистоты мембранных фракций удобнее использовать не ферменты, а специфические рецепторы лектинов, гормонов, антител. В том случае, если мембрана имеет четкие морфологические признаки, в качестве критерия применяют метод электронной микроскопии. Если хорошо изучен химический состав определенного типа мембран, то для контроля чистоты мембранных структур используют анализ белкового и липидного состава (например, методом электрофореза в ПААГ в присутствии ДСН или путем определения содержания холестерина).
5.4.