5.1. КРАТКИЙ ОБЗОР ГРУПП МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ БИОМЕМБРАН

Методы исследования биологических мембран весьма разно­образны и условно объединены в 5 групп: биохимические, физио­логические, иммунологические, генетические, биофизические.

Биохимические методы позволяют разделять, выделять и анализировать в чистом виде липидные и белковые компоненты, изучать их физико-химические свойства в свободном состоянии и в составе надмолекулярных комплексов в условиях воздействия различных внешних факторов (температуры, концентрации водо­родных ионов и др.), исследовать их время «жизни», пути биосин­теза и распада этих компонентов.

Физиологические методы используют для изучения функ­ционирования естественных и искусственных мембран. Они по­зволяют исследовать проницаемость мембран, процессы возбуж­дения, торможения, проведения нервного импульса, распределе­ния и выведения иоЬов и молекул из клеток и тканей, измене­ния физиологических функций клеток.

Иммунологические методы широко используются для иден­тификации мембранных компонентов, их локализации, оценки количества, выделения. Это методы получения поликлональных и моноклональных антител к компонентам мембран, иммуно- блоттинг (электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия с перенесением разделенных белков на нитроцеллюлозные фильтры для последующего выявления с по­мощью антител), иммунологическая очистка субклеточных фрак­ций, иммунологическое выделение мембранных компонентов, использование антител для отбора комплементарных ДНК, ко­дирующих мембранные белки.

Генетические методи основаны на использовании мутантов, дефектных по синтезу определенных мембранных белков. Они позволяют исследовать функции мембранных белков, их роль в функционировании мембран, проблемы самоорганизации мемб­ран.

Биофизические методы позволяют изучать динамическую организацию биомембран, получить представления об упаковке и движении липидных молекул в природных и модельных мем­бранах, их взаимодействии друг с другом и молекулами белков, исследовать фазовые переходы и другие процессы. К ним отно­сятся дифракционные методы (рентгеновская дифракция, диф­ракция нейтронов), резонансные методы, метод электронной мик­роскопии, оптические методы (круговой дихроизм, дисперсия оп­тического вращения, абсорбционная спектроскопия, люминесцен­ция, метод флуоресцентных зондов), метод дифференциальной сканирующей микрокалориметрии, метод моделирования и по­лучения искусственных мембран и др.

Дифракционные методы основаны на взаимодействии электро­магнитного излучения или частиц с длиной волны, соизмеримой с межатомным расстоянием, и компонентов мембраны. Их ис­пользуют для определения геометрических параметров структу­ры: типа липидной мезофазы и ее периодичности, толщины би­слоя, среднего расстояния между углеводородными цепями. К этим методам относятся рентгеновская дифракция (рентгено­структурный анализ) и дифракция нейтронов.

В основе рентгеноструктурного анализа лежит взаи­модействие рентгеновского излучения с электронами вещества, в результате которого возникает дифракция рентгеновских лучей с длиной волны - 0,1 нм. Последние рассеиваются на электрон­ных оболочках атомов. Интерференция волн, рассеянных веще­ством, приводит к возникновению дифракционной картины, что позволяет зарегистрировать рентгенограмму. При рассеянии на кристалле можно рассматривать дифракцию как отражение рен­тгеновских лучей плоскостями кристаллической решетки. Ди­фракция наблюдается, если рассеянные волны находятся в фазе, т.е. разность хода лучей равна целому числу волн п.

Условие дифракции (отражения) описывает формула Брэг­га—Вульфа:

пХ = 2 d sin 0,

где X — длина волны; d — расстояние между кристаллическими плоскостями; © — угол между направлением падающего луча и кристаллической плоскостью.

На основании дифракционной картины, получаемой для рент­геновских лучей с известной длиной волны, определяют пара­метр d. Дифракционная картина зависит от длины волны рент­геновских лучей и строения объекта. Анализ дифракционных максимумов позволяет установить распределение электронной плотности в кристалле. Рентгеноструктурный анализ дает ин­формацию о расположении атомов в молекулах и кристаллах.

Для построения профилей электронной плотности, а также для изучения ориентации и характера упаковки углеводород­ных цепей используют мультислои липидов или смесей липидов и белков, ориентированные на твердой подложке. Их получают путем постепенного нанесения липидов при многократном про­хождении стеклянной пластины сквозь монослой липида на гра­нице раздела вода — воздух или путем спонтанного образования мультислоев, параллельных подложке, при испарении органичес­кого растворителя из капли липидного раствора.

Метод рентгеновской дифракции позволяет установить нали­чие бислойной структуры в природных и модельных мембранах и определить параметры бислоя. На основании анализа дифрак­ционной картины можно исследовать состояние углеводородных цепей мембранных липидов и зарегистрировать фазовый пере­ход из гелеобразного в жидкокристаллическое состояние. Одна­ко из-за высокой лабильности и сравнительно малой упорядо­ченности структуры биомембран метод рентгеноструктурного анализа не позволяет изучить локализацию мембранных белков. Лишь в мембранах, содержащих упорядоченные белковые комп­лексы, удается выявить наличие и ориентацию а-спиральных участков интегральных белков.

С помощью метода дифракции нейтронов, дополня­ющего рентгеноструктурный анализ, определяют расположение молекул и их частей в бислое путем изотопного замещения водо­рода на дейтерий.

ми и тяжелыми атомами. Взаимодействие с некоторыми ядрами, имеющими соответствующие резонансные уровни энергии, при­водит к изменению знака амплитуды рассеяния. Амплитуда ко­герентного рассеяния ядром (Ь) связана с эффективным сечени­ем (о) соотношением: b = д/сМя . Различие в рассеянии нейтро­нов атомами водорода и дейтерия позволяет широко использо­вать эффекты изотопного замещения для изучения биомембран.

Резонансные методы анализа веществ подразделяют на ме­тод ядерного магнитного резонанса (ЯМР) и метод электронного парамагнитного резонанса (ЭПР).

Метод ЯМР основан на резонансном поглощении в силь­ном внешнем магнитном поле энергии электромагнитного ра­диочастотного поля системой атомных ядер, обладающих маг­нитным моментом. Он позволяет получать сведения о подвиж­ности молекул липидов биомембран, об упаковке фосфолипид­ных молекул в бислое, используется для регистрации изменений значения pH в частицах малого размера (искусственные мемб­раны, митохондрии), изучать процессы латеральной диффузии липидов и трансбислойного движения (“флип-флоп”-переходы) молекул.

Положение спектральной линии ЯМР относительно некото­рой эталонной линии называют химическим сдвигом. Химичес­кий сдвиг (5) — это отношение сдвига частоты поля (Доэ) к эта­лонному значению (о>₀), умноженное на 10^е:

где Н_о — напряженность постоянного магнитного поля.

Величина 8 для алифатических протонов варьирует от -0,5 до -2,0, ароматических протонов — от -6,0 до -8,5. В качестве эталона для протонного резонанса органических соединений ис­пользуют тетраметилсилан (CH₃)₄Si, а для водных растворов био­полимеров — 2,2-диметил-2-силанпентан-5-сульфоновую кисло­ту (ДСС). При высоком разрешении наблюдается сверхтонкая (мультиплетная) структура линий ЯМР, возникающая вследствие магнитного взаимодействия между ядрами, передаваемого через электроны связи (непрямое спин-спиновое взаимодействие).

К недостаткам метода ЯМР следует отнести низкую чувстви­тельность (концентрация образца должна быть не менее 10~^а моль/л), а также малую эффективность в изучении крупных молекул, т.е. мембранных белков.

Метод ЭПР — это резонансное поглощение энергии электро­магнитных колебаний в сантиметровом или миллиметровом ди­апазоне длин волн веществами, содержащими парамагнитные ча­стицы (молекулы, атомы, ионы, свободные радикалы, слабо свя­занные с атомом электроны). Условие резонанса, при соблюде­нии которого образец поглощает электромагнитную энергию, опи­сывают уравнением

где h — постоянная Планка; v — частота переменного электро­магнитного поля; АЕ — разность энергий между магнитными под­уровнями, которые образуются в результате расщепления уров­ней энергии парамагнитной частицы в постоянном магнитном поле Н; g — фактор расщепления (отношение магнитного мо­мента парамагнитной частицы к ее механическому моменту (спи­ну); Р — магнетон Бора.

Метод ЭПР основан на введении в липидный бислой парамаг­нитных меток и зондов. Основу спиновых меток и зондов состав­ляет стабильный свободный иминоксильный (нитроксильный) радикал с неспаренным электроном, локализованным преиму­щественно у атома азота:

Если производное такого радикала присоединяется к белку или липиду ковалентной связью, то такое производное называют спиновой меткой, а если с помощью электростатических сил и гидрофобных взаимодействий —-то спиновым зондом.

Выбор спинового зонда или метки определяется задачами ис­следования. Так, для изучения характера движения липидных молекул используют липофильные спин-меченные жирные кис­лоты, глико- и фосфолипиды. Последние применяют также для исследования латерального фазового разделения липидов и ли­пид-белковых взаимодействий.

Некоторые амфифильные зонды, в частности 2,2,6,6-тетра- метилпиперидин-М-оксил (TEMPO), растворяются частично в уг­леводородной зоне мембраны, а частично — в ее полярной облас­ти, Поэтому их спектры зависят от полярности окружения.

Гидрофильные спиновые зонды, представляющие собой мо­дификацию зонда TEMPO и изменяющие свой заряд в зависимо­сти от величины pH, способны связываться с различными участ­ками полярных групп мембраны за счет электростатических вза­имодействий. Их используют для исследования поверхностного потенциала и плотности заряда мембранной поверхности.

Более предпочтительным для изучения биомембран являет­ся одновременное применение нескольких зондов, по-разному вза­имодействующих с компонентами мембран, что позволяет иссле­довать цитоплазматическую и наружную поверхности мембран клеток и клеточных органелл.

Таким образом, метод ЭПР применяют для изучения фазо­вых переходов в липидном бислое, микровязкости мембран, под­вижности углеводородных цепей, латеральной диффузии и “флип- флоп”-переходов. Недостаток этого метода заключается в том, что введение зонда изменяет структуру бислоя и свойства мемб­раны. Метод ЭПР более чувствителен по сравнению с методом ЯМР, так как магнитный момент электрона в 1000 раз выше, чем ядра.

С помощью метода электронной микроскопии (разрешающая способность электронного микроскопа находится в диапазоне 2— 4 нм и превышает таковую для оптического микроскопа более чем в 500 раз) исследуют морфологию внутренних поверхностей двух монослоев, распределение фаз в мембране, трехмерную моле­кулярную структуру мембранных белков, форму и размеры солю­билизированных мембранных белков. Однако необходимость про­ведения обезвоживания, фиксации и контрастирования объекта солями тяжелых металлов приводит к существенной модифика­ции структурного состояния компонентов мембран.

Разновидность метода электронной микроскопии — “замора­живание—скалывание”. Его применяют для изучения характера связывания белков с мембранами. Для этого образец, не требую­щий химической фиксации, замораживают в жидком азоте, а затем раскалывают в плоскости наименьшего сопротивления хо­лодным ножом в вакууме. Плоскость наименьшего сопротивле­ния проходит между двумя слоями липидной фазы мембраны. Далее поверхность образца покрывается платиной и углеродом, его растворяют и отпечаток (реплику) рассматривают в элект­ронный микроскоп. Бели лед возгоняют с поверхности образца, то модификацию метода называют “замораживание—травление”.

Оптические методы позволяют получить информацию о ме­ханизме фотосинтеза, электронном транспорте, транспорте кис­лорода в тканях, транспорте ионов, взаимодействии веществ раз­личной природы с мембранами, белок-липидных взаимодействи­ях и других процессах. Они основаны на присутствии в изучае­мой системе эндогенных или экзогенных (вносимых в систему экспериментатором) хромофорных групп. К эндогенным хромо­форам относятся порфирины, флавины, каротиноиды, пиридин­нуклеотиды, цитохромы, гемоглобин, миоглобин, которые погло­щают свет в видимой области спектра. Акридины, нафталин- сульфонаты, цианины являются экзогенными хромофорами. К оптическим методам относят абсорбционную спектрофотомет­рию, люминесценцию, метод флуоресцентных зондов, а также кру­говой дихроизм, дисперсию оптического вращения. Последние наряду с ИК-спектроскопией и спектроскопией комбинационно­го рассеяния используются для определения содержания различ­ных элементов вторичной структуры молекулы белка, позволя­ют изучать ее конформационные переходы.

Люминесценция наблюдается в результате поглощения веществом энергии возбуждения, перехода его частиц из основ­ного в возбужденное электронное состояние и обратно. Она пред­ставляет собой свечение атомов, ионов, молекул и их комплек­сов, возникающее в результате электронного перехода из возбуж­денного состояния в основное.

Все известные виды люминесценции подразделяют на два больших класса: флуоресценцию и фосфоресценцию. Под флу­оресценцией понимают свечение, мгновенно (10“^в с) затухаю­щее после прекращения возбуждения. Квант флуоресценции испускается при переходе из синглетного возбужденного со­стояния Sj (с его нижнего колебательного подуровня) в синг­летное основное состояние S_o: S_t* —» S_o + hv^. Фосфоресцен­ция — свечение, продолжающееся в течение длительного про­межутка времени (>10'^с с) после прекращения возбуждения. Квант фосфоресценции высвечивается при переходе (с обра­щением спина) электрона из триплетного возбужденного со­стояния Т, в основное состояние: Т, -> S_n + hv^. .

1 10 фас

Есть и другие виды классификации люминесценции: по типу возбуждения свечения и кинетике процесса люминесценции. Так, в случае возбуждения вещества световыми квантами возникаю­щее при этом свечение называется фотолюминесценцией.

В зависимости от кинетических характеристик свечения вы­деляют резонансную, спонтанную, вынужденную и рекомбина­ционную люминесценцию.

Резонансная флуоресценция — основа процесса атомной лю­минесценции — представляет собой излучение фотонов той же энергии, что и у поглощенных фотонов возбуждающего света; наблюдается в газах и кристаллах.

При спонтанной люминесценции после возбуждения молеку­ла сначала переходит на высокий возбужденный электронный уровень S₂, а затем путем безызлучательного перехода — на бо­лее низкий возбужденный уровень S_x. Квант люминесценции вы­свечивается при переходе Sj S_o, поэтому его величина оказыва­ется меньше, чем у поглощенного кванта. Спонтанная люминес­ценция наблюдается у паров, растворов сложных молекул, моле­кулярных кристаллов.

Вынужденная люминесценция характерна для сложных орга­нических молекул, находящихся при низкой температуре или в жестких средах. В этом случае при возбуждении молекула пере­ходит из состояния S_o в возбужденные состояния S₂* и б/, затем безызлучательным путем — в Т (триплетное), переход из кото­рого в S_o запрещен правилами отбора. За счет внутренней коле­бательной энергии или сообщенной извне тепловой энергии осу­ществляется переход в основное состояние с испусканием кванта люминесценции.

Спонтанный и вынужденный типы излучения наиболее ха­рактерны для молекулярных систем и поэтому их называют мо­лекулярной люминесценцией.

Рекомбинационная люминесценция наблюдается у газов и сложных неорганических кристаллов в случае рекомбинации ра­дикалов или ионов с образованием их возбужденных молекул.

Спектром люминесценции вещества называют зависимость интенсивности люминесценции от длины волны (частоты) изме­ряемого света. Спектр возбуждения люминесценции — это зави­симость интенсивности люминесценции от длины волны воз­буждающего света.

Теоретически спектры возбуждения люминесценции молекул должны быть идентичны по форме их спектрам поглощения и не зависеть от длины волны измерения флуоресценции. Однако чаще всего на практике эти спектры отличаются вследствие раз­личий физико-химических свойств молекул в основном и воз­бужденном состояниях. Например, в возбужденном состоянии могут изменяться геометрические параметры, межатомные рас­стояния и, следовательно, дипольные моменты молекул, степень диссоциации последних. Для устранения кажущихся различий между спектрами поглощения и возбуждения необходимо соблю­дение следующих условий: а) одинаковой интенсивности возбуж­дающего света во всем диапазоне частот; б) отсутствие вторично­го поглощения исследуемого излучения.

Форма спектра люминесценции (правило Каши) и квантовый выход (закон Вавилова) не зависят от длины волны возбуждаю­щего света. Это обусловлено тем, что при поглощении больших квантов возбуждающего света происходит переход молекул из основного состояния S_o в возбужденные S₂*, S₃*, однако излуча­тельный переход осуществляется только из состояния S/ (люми­несценция), а переходы S₂* —> S/, S₃* -> S/ происходят безызлуча- тельно.

Согласно правилу Стокса частоты возбуждающего света все­гда больше или равны частотам люминесценции: т. е.

одна часть поглощаемой молекулой энергии идет на возбужде­ние люминесценции, а другая расходуется на увеличение ее ко­лебательной энергии и развитие безызлучательных переходов. Однако строгое выполнение правила Стокса наблюдается у ато­мов и простых молекул в газовой фазе. Спектры поглощения и люминесценции молекул могут перекрываться, т.е. значения ча­стот переходов между электронными уровнями при поглощении могут быть меньше, чем при испускании. Следовательно, наблю­дается нарушение правила Стокса. Часть спектра люминесцен­ции, где выполняется правило Стокса, называется стоксовой об­ластью, а где оно нарушается— антистоксовой. Поэтому это пра­вило характеризует одиночный акт поглощения и испускания света молекулой.

В соответствии с законом Стокса—Ломмеля спектр излуче­ния и его максимум всегда сдвинуты по сравнению со спектром поглощения и его максимумом в сторону более длинных волн:

hv ^люм < hv ^1ШГЛ

макс макс

Этот закон носит статистический характер и описывает по­глощательные и излучательные свойства совокупности молекул исследуемого образца. Поэтому образование антистоксовой об­ласти спектра люминесценции не противоречит закону сохра­нения энергии: колебательная энергия молекул частично пре­образуется в энергию их люминесценции, что удовлетворяет ус­ловию: hv > hv

Л ЮМ ПСІГЛ

Закон Стокса—Ломмеля является качественным выражени­ем правила зеркальной симметрии спектров поглощения и лю­минесценции Левшина, которое гласит: спектры поглощения и люминесценции зеркально симметричны относительно прямой, проходящей перпендикулярно к оси частот (длин волн) через точку пересечения спектров.

Эффективность процесса превращения энергии возбуждаю­щего света в энергию люминесценции характеризуется кванто­вым выходом люминесценции. Это отношение числа высвечен­ных квантов люминесценции к числу поглощенных квантов воз­буждающего света.

Молекулы люминесцирующих веществ оптически анизо­тропны, поэтому люминесцентное излучение каждой молеку­лы частично поляризовано. Если анизотропные молекулы ори­ентированы хаотично, то вещество в целом становится изо­тропным, а его люминесценция — неполяризованной. При воз­буждении вещества линейно-поляризованным светом его по­глощение осуществляется молекулами, у которых поглощаю­щий осциллятор параллелен электрическому вектору падаю­щего света. Поэтому поглощение полностью отсутствует у мо­лекул, поглощающий осциллятор которых перпендикулярен электрическому вектору возбуждающего света. В этом случае измеряют поляризационные спектры флуоресценции — зави­симость степени поляризации флуоресценции объекта от дли­ны волны возбуждающего света (поляризационные спектры по поглощению) или длины волны регистрации при фиксиро­ванной длине волны возбуждения (поляризационные спектры по испусканию).

Для количественной оценки поляризованной люминесценции используют степень поляризации (Р) люминесценции:

р = (1_п - 1_Х)/(1_П + IJ,

где 1„ и 1_ — соответственно параллельная и перпендикулярная электрическому вектору возбуждающего света составляющие по­ляризованной люминесценции.

Степень анизотропии (г ) излучения определяется по форму­ле:

Использование этой характеристики для описания процессов поляризованной люминесценции более корректно, так как учи­тывает третью составляющую, перпендикулярную электрическому вектору возбуждающего света (т.е. в знаменателе уравнения для определения г находится величина, пропорциональная суммар­ному значению интенсивности).

Связь между величинами Риг отражает следующее уравне­ние:

Анизотропия оптической среды проявляется как при испус­кании, так и при поглощении света. Для характеристики ани­зотропии поглощения света используют степень дихроизма d:

где D_n и D_±—- оптические плотности, измеренные при облучении исследуемого образца линейно-поляризованным светом с коле­баниями электрического вектора, параллельными и перпендику­лярными главной оптической оси системы.

Перреном и Яблонским установлена связь между степенью поляризации (Р) флуоресценции и вязкостью среды (ц):

где Р_о — предельное значение поляризации при Т/р —> 0; R — универсальная газовая постоянная; Т — абсолютная температу­ра; V — объем моля флуоресцирующих молекул; т — время жиз­ни возбужденного состояния. Этой формулой пользуются для рас­чета значений т.

Варьируя угол направления поляризации флуоресценции, ус­танавливают направление и степень ориентации молекул в ана­лизируемом образце. Исследование поляризации флуоресценции позволяет изучать миграцию энергии в биосистемах, определять размеры биомакромолекул и время жизни их возбужденного со­стояния. Поляризацию флуоресценции определяют для того, что­бы судить о микровязкости мембраны.

Так, микровязкость мембраны изучают путем измерения Р для флуоресцентного зонда, введенного в исследуемую систему. Метод флуоресцентных зондов подробно рассмотрен в разделе 6.4.

В целом флуоресцентный метод анализа — один из безынер­ционных, высокочувствительных методов исследования, приме­няемых для качественного и количественного анализа смесей ве­ществ, изучения механизма фотофизических и фотохимических процессов в биосистемах и конформационных свойств биомакро­молекул.

Инфракрасная (ИК) спектроскопия занимается анализом молекулярных спектров, так как в ИК-области спект­ра (10 000—400 см'¹) расположено большинство колебательных и вращательных спектров молекул. В ИК-диапазоне поглощает­ся свет тех частот, которые равны частотам колебаний атомов в молекуле. ИК-спектр поглощения, возникающий в результате по­глощения ИК-излучения при прохождении его через вещество, состоит из большого числа полос, причем часть полос поглоще­ния обусловлена колебаниями отдельных атомных группировок, более или менее сохраняющих свои свойства в разных молеку­лах. Характеристики ИК-спектра (число полос поглощения, их положение, определяемое частотой v или длиной волны X, шири­на и форма, интенсивность поглощения в максимумах) определя­ются структурой и химическим составом поглощающего веще­ства и зависят от его структурного состояния, а также темпера­туры, давления и других факторов. Метод ИК-спектроскопии позволяет определять структуру молекул, их химический состав, моменты инерции, величины сил, действующих между атомами в молекуле, проводить качественный и количественный анализ смесей различных веществ.

Сущность одного из видов метода ИК-спектроскопии — ИК-ди­хроизма — заключается в измерении разности поглощения све­та, поляризованного вдоль оси ориентации и перпендикулярно этой оси ориентации молекулы. С помощью измерения ИК-дих- роизма можно установить, как направлены важнейшие группы белка (> С = О и -NH) по отношению к оси его макромолекулы. Необходимыми для определения частотами пептидной связи бел­ков являются следующие: 3330 см'¹ для валентного колебания - NH-группы (колебание ядер вдоль линии связи между атомами в молекуле), 1660 см'¹ для валентного колебания >СО-группы и 1550 см'¹ для деформационного колебания (колебания, обуслов­ленные периодическими изменениями угла между связями от­дельных атомов в молекуле ) NH-группы. Анализ смещения этих полос поглощения, изменения их ширины, формы, величины ПО-

глощения позволяет судить о состоянии вторичной структуры белков и полипептидов.

Дисперсия оптического вращения (оптической ак­тивности) — зависимость угла вращения (поворота) плоскости поляризации света (0), либо против часовой стрелки (ф0) и левовращающие (отри­цательно вращающие — I, ф