МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ АСКОРБАТОКСИДАЗЫ, ПОЛИФЕНОЛОКСИДАЗЫ И ПЕРОКСИДАЗЫ (по Д.К. Асимову, С.Т. Рахимовой)

В биохимических исследованиях чаще используются методы совмест­ного определения активности аскорбатоксидазы и полифенолоксидазы, ос­нованные на определении количества окисленной аскорбиновой кислоты.

Разработанный колориметрический метод определения аскорбиновой кислоты позволил полностью избавиться от недостатков титрометрическо­го метода и благодаря своей простоте и хорошей воспроизводимости ши­роко применяется в биохимической практике. В этой связи данный метод [1] использовался нами для определения активности аскорбатоксидазы, полифенолоксидазы и пероксидазы [2].

Для приготовления раствора краски - 2,6-дихлорфенолиндофенола - в колбе объемом 100 мл растворяли 25 мг навески в теплой дистиллирован­ной воде и добавляли 3-4 капли 0,01 и. раствора едкого натрия. Колбу встряхивали до полного растворения краски, и объем раствора доводили до метки водой.

Взвешивали 50 мг чистой аскорбиновой кислоты и растворяли в 0,5 л 2%-ной метафосфорной кислоте. Из этого раствора брали по 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5; 3; 3,5 мл и доводили до 50 мл 2%-ной метафосфорной кислотой. Как известно, метафосфорная кислота является одним из лучших стабилизато­ров аскорбиновой кислоты в растворе; кроме того, она легко осаждает белки. Полученные растворы содержали соответственно 1, 2, 3, 4, 5, 6 и 7 мкг аскорбиновой кислоты в 1 мл раствора. Нулевую точку на спектрофо- метре устанавливали по 2%-ной метафосфорной кислоте. Из приготовлен­ных растворов брали по 10 мл и добавляли по 1 мл свежеприготовленной краски.

Для опыта брали свежие растительные материалы по 1 г и растирали в ступке с фосфатным буфером pH 5 и pH 7,5. Время экстракции материала - 30 минут при комнатной температуре. Затем экстракт количественно пере­несли в мерную колбу объемом 50 мл и довели буфером до метки. Полу­ченную ферментную вытяжку отфильтровали.

Брали три колбы на 50 мл: в две из них вносили по 4 мл ферментной вытяжки, приготовленной на буфере pH 5, добавляли 2,5 мл буферного раствора и 2,5 мл 0,2%-го раствора аскорбиновой кислоты. В третьей колбе проводили контрольные определения: в нее вносили 1 мл 20%-ной мета­фосфорной кислоты, 4 мл ферментной вытяжки, 2,5 мл буфера pH 5 и 2,5 мл 0,2%-ного раствора аскорбиновой кислоты. Опытные пробы встряхива­ли на качалке 30 минут, по истечении этого времени в колбы наливали по 1 мл 20%-ной метафосфорной кислоты. Контрольные колбы не встряхива­ли, в них определяли содержание аскорбиновой кислоты. Для этого из ре­акционных смесей контрольных и опытных проб брали по 0,5 мл и дово­дили объем до 50 мл 2%-ной метафосфорной кислотой. Из этого раствора брали 10 мл и добавляли 1 мл краски, затем через 35 секунд определяли оптическую плотность на спектрофотометре. Об активности аскорбатокси- дазы судили по количеству окисленной аскорбиновой кислоты, которое находили по разнице между контролем и опытом.

Чтобы определить активность полифенолоксидазы, брали шесть колб. В две колбы наливали по 2 мл ферментной вытяжки, приготовленной на буфере pH 5, добавляли 2 мл того же буфера и вносили по 2,5 мл 2%-ного раствора аскорбиновой кислоты и 2,5 мл 0,5%-ного раствора пирокатехи­на.

После 30-минутного встряхивания в опытные пробы добавляли по 1 мл 20%-ной метафосфорной кислоты и определяли аскорбиновую кислоту. В данном случае определяли суммарное действие аскорбатоксидазы и поли- фенолксидазы, а об активности полифенолоксидазы судили по разности между двумя определениями (активность полифенолоксидазы + аскорба­токсидазы за вычетом активности аскорбатоксидазы).

Для этого брали три колбы, в две из них вносили по 1 мл ферментной вытяжки, приготовленной на буфере pH 7,5, добавляли 2 мл буферного раствора pH 7,5, 2,5 мл 0,2%-ного раствора аскорбиновой кислоты, 2,5 мл пирокатехина и 1 мл 0,09 М Н2О2. В третей колбе проводили контрольные определения. В нее вносили 1 мл 20%-ной метафосфорной кислоты, 1 мл ферментной вытяжки, 2 мл буфера pH 7,5 и те же количества аскорбиновой кислоты, пирокатехина и перекиси. Об активности пероксидазы судили по разнице между двумя определениями (полифенолоксидаза + пероксидаза за вычетом активности полифенолоксидазы).

Литература

1. Чупахина Г.Н. Количественное определение аскорбиновой кислоты коло­риметрическим методом // Специальный практикум по биохимии и физиологии растений. Томск: Изд-во ТГУ, 1974. С.27-31.

2. Асамов Д.К., Рахимова С.Т. К методике определения активности аскорба­токсидазы, полифенолоксидазы и пероксидазы // Актуальные вопросы физиоло­гии, биохимии и биотехнологии. Ташкент: Изд-во ТГУ, 1991.С. 122-126.