Выделение легкорастворимых и ионосвязанных пероксидаз и определение их активности

Активность растворимых и ионосвязанных с клеточными стенками пероксидаз определяли по скорости окисления гваякола по стандартной методике (Lin, Као, 1999). Всю процедуру экстракции пероксидаз проводили при 0-4^oC.

Экстракт, содержащий растворимые, в основном вокуолярные пероксидазы, отделяли центрифугированием (10 мин 2000 g) и очищали от мешающих определению пероксидазной активности низкомолекулярных соединений (смол, аскорбиновой кислоты) пропусканием через колонку сефадекса G-25. Для этого 1 мл экстракта наносили на колонку объемом 4 мл и проводили элюцию экстрагирующим (К-фосфат-цитратным) буферным раствором. Пероксидазы собирали во 2-м и 3-м миллилитрах элюата.

Для выделения ионосвязанных с клеточными стенками пероксидаз осадок промывали 5 мл экстрагирующего буферного раствора, содержащего 0,2% детергента тритона X-100, очищая клеточные стенки от мембранных компонентов. Супернатант отделяли центрифугированием (10 мин 2000g) и отбрасывали. Затем осадок промывали 5 мл экстрагирующего буферного раствора и центрифугировали при тех же условиях. Ионосвязанные с клеточными стенками пероксидазы экстрагировали из промытого осадка посредством 30-минутной инкубации в 1 мл IM NaCl, экстракт отделяли центрифугированием (10 мин 4000g).

Активность пероксидаз определяли в реакционной смеси объемом 3 мл, содержащей 2 мл пробы, а также 100 мМ ацетатного буфера с pH 5, 20 мМ гваякола, 4 мМ пероксида водорода. Реакцию проводили при комнатной температуре. Пероксидазную активность оценивали по скорости образования продукта реакции тетрагваякола (B₄₇O_hm= 0,0266 mkM^-1cm^-1; величина поглощения тетрагваякола при ее концентрации 0,1 мкМ/см) на линейном участке реакционной кривой (2-ая мин реакции) и относили к 1 г сырой массы, измеряя каждые 0,5 мин интенсивность окраски на спектрофотометре СФ-46, ЛОМО.

2.2.3.5.