Динамика активности пероксидаз в процессе длительного низкотемпературного хранения in vitro
Пероксидазьт, которые являются очень чувствительными индикаторами стрессовых воздействий, способны вырабатывать пероксид водорода путем окисления различных субстратов молекулярным кислородом (Smith et al., 1982; Otter, Polle, 1997).
В то же время, как упоминалось выше, пероксидазы могут окислять многие вещества, используя в качестве окислителя пероксид водорода. Для выяснения роли пероксидаз в адаптивном ответе микрорастений ежевики к возможным стрессовым факторам во время их длительного хранения на следующем этапе работы была анализирована динамика активности пероксидаз (суммарная активность легкорастворимых и ионосвязанных с клеточными стенками пероксидаз) в листьях ежевики в процессе низкотемпературного in vitro хранения в течение 12 месяцев. На первых этапах хранения (4-8 месяцев) активность пероксидаз возрастала в среднем до 339÷32% (рис. 14), что, по- видимому, и является причиной поддержания низкого уровня пероксида водорода в тканях листьев ежевики.
Время, месяцы
Рис. 14. Динамика активности пероксидаз (суммарная активность легкорастворимых и ионосвязанных с клеточными стенками пероксидаз) в листьях микрорастений ежевики при длительном хранении in vitro при температуре +4oC.
C увеличением сроков хранения происходило снижение активности пероксидаз (до 204±27%), в то время как содержание пероксида водорода при этом постепенно повышалось (рис. 13). Вероятно, в начальный период хранения высокая активность пероксидаз способствовала поддержанию содержания пероксида водорода на низком уровне. Наиболее интенсивное повышение активности пероксидаз среди исследуемых сортов ежевики наблюдалось у сорта Merton Thomless (на всех сроках хранения) (табл. 18 приложения).
Выявлена тенденция к наличию обратной зависимости между активностью пероксидаз и уровнем пероксида водорода (г = -0,48) (рис.
13, 14, табл. 17, 18). Так, растения сорта Merton Thomless отличались от других сортов наиболее низким содержанием пероксида водорода к 12-месяцу хранения. И, наоборот, у растений сорта Whitford Thomless, которые отличались наиболее низкой активностью пероксидаз, наблюдался высокий уровень пероксида водорода. Эти факты подтверждают важность роли пероксидаз в процессе адаптации растений к стрессовым факторам условий хранения и в утилизации пероксида водорода.Отдельные измерения активности легкорастворимых и ионосвязанных с
клеточными стенками пероксидаз показали, что легкорастворимые пероксидазы проявляют в 5-15 раз более низкую активность по сравнению с активностью ионосвязанных пероксидаз (табл. 18-20 приложения). Это означает, что основное количество пероксидаз, вероятно, связано с клеточными стенками. Также было отмечено, что активность фермента в листьях нижнего яруса вдвое выше, чем в листьях верхнего. Это объясняется тем, что активность пероксидаз повышается по мере дифференцировки клеток (MacAdam, Nelson, Sharp, 1992; Jackson, Ricardo, 1998). Таким образом, выявлена тенденция к наличию обратной зависимости между содержанием пероксида водорода и активностью пероксидаз в листьях верхнего и листьях нижнего ярусов. Так, уровень пероксида водорода в листьях верхнего яруса выше, чем в листьях нижнего яруса, в то время как активность фермента выше в листьях нижнего яруса, чем в листьях верхнего (табл. 19, 20 приложения).
Литературные данные и результаты нашей работы позволяют предположить, что активность пероксидаз в растениях ежевики повышается под воздействием пониженных температур, которые стимулируют адаптивный ответ организма на стресс. Понижение активности пероксидаз в листьях ежевики при более длительном хранении в условиях низких температур, возможно, связано с естественным старением растений. К тому же пероксидазы могут быстро инактивироваться при большой концентрации пероксида водорода (Zhanget et al., 1997). Поэтому гваякол-пероксидазы, а также компоненты аскорбат- глутатионового пути, вероятно, не способны справляться длительное время с избыточным образованием пероксида водорода.
В условиях стресса, который ослабляет синтез белков, например при низкой температуре, может наблюдаться уменьшение содержания фермента и его активности (Hertwig, Streb, Feierabend, 1992). Необходим постоянный синтез белков, чтобы поддержать активность ферментов: в условиях, когда распад превосходит синтез и активность ферментов может уменьшиться (Feierabend, Engel, 1986).Как уже отмечалось, пероксидазы — это основные компоненты, утилизирующие пероксид водорода в листьях. В литературе имеются данные о том, что между активностью фермента и концентрацией пероксида водорода существует обратно пропорциональная зависимость (Fry, Willis, Paterson, 2000).
Пероксидазы могут перерабатывать пероксид водорода, образующийся в фотосинтетической цепочке транспорта электронов. Однако, возможно, что небольшое количество пероксидаз просто не может поддержать достаточно низкий уровень пероксида водорода в листьях растений (Puntarulo et al., 1991). Вероятно, по этой причине происходит повышение уровня пероксида водорода в листьях микрорастений ежевики при длительном хранении.
Когда пероксид водорода накапливается, то взаимодействует с сигнальными системами, например, гормонами и вторичными посредниками, например, с ионами Ca2+ (Scandalios, Guan, Polidoros, 1997), что тоже объясняет его влияние на ростовые процессы. В растениях пероксид водорода регулирует рост клеток растяжением, влияя растяжимость клеточных стенок за счет окислительных сшивок гликопротеинов клеточной стенки и полисахаридов, которые образуются при участии пероксидаз (Fry, 1986; Hohl, Greiner, Schopfer, 1995; Schopfer, 1996). Пероксидазы клеточных стенок катализируют образование окислительных связей между остатками фенольных соединений в составе белков, гемицеллюлоз и пектинов клеточных стенок (Pallanca, Smimoff, 2000). Для активности фермента и скорости роста характерна обратная корреляция. Например, в зоне растяжения листьев злаков увеличение активности пероксидаз стимулирует снижение скорости роста клеток (MacAdam, Nelson, Sharp, 1992). В условиях низких температур (+4oC) рост микрорастений ежевики происходил медленно с самого начала хранения, в то время как рост микрорастений, выращенных при +220C, осуществлялся интенсивней именно на первых этапах хранения. Причиной торможения роста растений ежевики при низких температурах может быть как высокая активность пероксидаз (рис. 9 г, 14), так и низкий уровень содержания пероксида водорода (рис. 9 г, 13).
У многих растений активность пероксидаз постепенно увеличивается не только по мере роста, но и при дифференцировке клеток (MacAdam., Nelson, Sharp, 1992; Jackson, Ricardo, 1998). Вполне вероятно, что изменения активности пероксидаз и содержания пероксида водорода при хранении растений ежевики в условиях низких температур также могли повлиять на замедление процесса образования новых листьев (рис. 9 б, 13, 14).
IOO