Пероксидазы
Пероксидазы относятся к гемсодержащим гликопротеидам, которые катализируют реакции оксидазного, пероксидазного и оксигеназного окисления субстратов (Tams, Welinder, 1998). Основной особенностью механизма действия пероксидаз является отсутствие специфичности выбора ферментом субстрата, проявляемой в реакциях индивидуального окисления.
Однако фермент способен проявлять специфичность в пероксидазных реакциях совместного окисления субстратов. Наличие у фермента двух различных функций (оксидазной и пероксидазной) говорит о том, что в каталитическом действии фермента принимают участие два независимых активных центра пероксидазы. Эти каталитические центры в молекуле фермента пространственно разделены. Полифункциональность пероксидаз модулируется ионами металлов и состоянием микросреды вблизи молекул (Rama et al., 1982). Все пероксидазы имеют консервативный каталитический центр, в который входит простетическая группа - протогематин IX, представляющий собой железопорфириновое кольцо. В процессе катализа происходит окисление пероксидазы пероксидом водорода, затем окисленный фермент последовательно отнимает два электрона от субстрата и возвращается в исходное состояние (Шарова, 2004).Пероксидазы растений относятся к классу так называемых гваяколпероксидаз (Welinder, 1992). Гваяколпероксидазы могут окислять многие вещества, используя в качестве окислителя пероксид водорода (Fujiyama et al., 1995). Основными субстратами пероксидаз в клеточных стенках растений служат фенольные соединения. Пероксидазы могут также проявлять оксидазную активность. В этом случае они способны вырабатывать пероксид водорода путем окисления различных субстратов молекулярным кислородом (Smith et al., 1982; Otter, Polle, 1997).
В клетках они локализованы в вакуолях и в клеточных стенках, куда поступают с помощью везикул, формирующихся в аппарате Гольджи. Поэтому гваяколпероксидазы также называют секреторными пероксидазами (Шарова, 2004).
В основном пероксидазы ионно связаны со структурными компонентами клеточных стенок и могут быть извлечены растворами нейтральных солей, например 0,1-1,0 M NaCl (Шарова, Суслов, 1998). Пероксидазы, ковалентносвязанные с полисахаридами клеточных стенок, извлекаются только после гидролиза полисахаридов (Шарова, 2004). Некоторые пероксидазы настолько слабо связаны с клеточными стенками, что легко диффундируют в инкубационную среду (Шарова, Суслов, 1998).Обычно в геноме растения содержится несколько десятков генов гваяколпероксидаз (Tams, Welinder, 1998). Они кодируют полипептиды, состоящие примерно из 300 аминокислотных остатков, которые сохраняются в зрелой молекуле, и сигнального N-пептида, состоящего из 15—22 аминокислотных остатков. В процессе транспорта фермента в клеточную стенку или в вакуоль N-пептид отщепляется. Отличительная особенность аминокислотного состава этих ферментов - отсутствие триптофана (Tams, Welinder, 1998). Степень гомологии первичной структуры изопероксидаз одного растения варьирует от 30 до 90%. Кроме того, пероксидазы подвергаются N-гликолизированию, и углеводы могут составлять от 2- 3 до 40% их молекулярной массы. Например, у щелочной пероксидазы из корня хрена степень гликолизирования составляет 20% и обнаружено восемь олигосахаридных цепей, в которых преобладают остатки маннозы и N- ацетилглюкозамина (Tams, Welinder, 1998). В результате в одном растении находится много изопероксидаз, которые можно посредством изоэлектической фокусировки разделить на катионные (pi > 7) и анионные (pi < 7). Значение pi изопероксидазы зависит не только от состава полипептида, но и от углеводной части молекулы. В клеточных стенках содержатся и щелочные, и кислые изопероксидазы (Sharova, Souslov, 2000). Обычно они активны в диапазоне pH 5-6,5 (Шарова, 2004).
Основная функция пероксидаз - окисление различных токсических метаболитов клетки и защита от вредного действия пероксида водорода и кислородных радикалов (Rama et al., 1982). Пероксид водорода утилизируется в основном при участии гваяколпероксидаз и аскорбатпероксидаз клеточных стенок (Шарова, 2004).
Пероксидазы могут окислять многие вещества, используя в качестве окислителя пероксид водорода (Fujiyama et al., 1995).Пероксидазы играют важную роль не только в утилизации пероксида водорода, но также и во многих других физиологических процессах клетки. Важное место пероксидазам принадлежит в окислительном метаболизме инфицированной клетки, так как она связана с системой защитных реакций растительного организма (Lee, Lin, 1996). Повреждение растений патогенами сопровождается возрастанием активности пероксидазы и изменением ее изозимного состава (Babior et al., 1973). При этом пероксидазы реагируют с фенольными соединениями, превращая их в соответствующие хиноны, токсичные для фитопатогенов (Foyer, Noctor, 2005).
Пероксидазы являются очень чувствительными индикаторами стрессовых воздействий. Увеличение их активности наблюдается при недостатке кислорода (Sandermann et al., 1998), при засухе и засолении почв, в условиях низких и высоких значений температур (Савич, 1989). При этом наблюдается тесная взаимосвязь между активностью пероксидаз и содержанием пероксида водорода, который накапливается при неблагоприятных условиях среды.
Можно предположить, что стрессовые воздействия, которые испытывают микрорастения при выращивании in vitro, также могут вызвать окислительный стресс. Поэтому для анализа повреждающего эффекта условий длительного хранения, возникает необходимость выявить динамику активности пероксидаз и содержания пероксида водорода в тканях микрорастений при их выращивании и хранении in vitro.
1.5.4.