ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ АСКОРБИНАТОКСИДАЗЫ
Аскорбинатоксидаза - фермент, катализирующий окисление аскорбиновой кислоты в дегидроаскорбиновую. В состав этого фермента входит медь (0,24%).
Наиболее активная аскорбинатоксидаза обнаружена в капусте, огурцах, тыкве, кабачках.
Ее активность можно определять по интенсивности поглощения кислорода (в аппарате Варбурга), по измерению путём титрования остатка неокисленной аскорбиновой кислоты в среде и спектрофотометрически. Ниже приводится описание двух последних методов.Определение активности аскорбинатоксидазы ведут по измерению остатка неокисленной аскорбиновой кислоты. Этот метод модифицирован Л.К. Островской [1].
Реактивы и аппаратура
1. Буферная смесь Мак-Ильвейна, pH 6.
2. Раствор аскорбиновой кислоты (1мг в 1см3).
3. 5%-ный раствор метафосфорной кислоты.
4. 0.001 н. раствор йодата калия - КЮз (навеску 0,3568 г йодата, высушенного в течение двух часов при 102°С растворяют в воде в мерной колбе объемом 1 дм3; в другую колбу на 1 дм3 берут 100 см3 и доводят водой до мерной черты.
5. 0,001 н. раствор 2, 6-дихлорфенолиндофенола - краска Тильманса (отвешивают на небольшом часовом стекле 60 мг сухой краски, переносят в мерную колбу на 200 см3, прибавляют 100 см3 дистиллированной воды и 4-5 капель 0,01 н. щелочи; взбалтывают в течение 10 минут, доводят дистиллированной водой до метки и фильтруют в сухую колбу).
6. 1%-ный раствор крахмала.
7. Микробюретка с градуировкой 0,01 см3, емкостью 5 см3.
8. Центрифуга.
Ход анализа
Навеску листьев 1-2 г (в зависимости от активности фермента) помещают в фарфоровую ступку и тщательно измельчают в присутствии буферной смеси Мак-Ильвейна, pH 6. Растертую массу переносят в мерную колбу на 25 или 50 см3, доводят буфером до метки и перемешивают. В коническую колбочку на 50 см3 вносят 2 см3 полученной вытяжки (гомогената, центрифугата или фильтрата), содержащей фермент, и приливают 2 см3 раствора аскорбиновой кислоты.
Колбы с содержимым выдерживают при температуре 25 или 30°С в течение часа. По окончании времени экспозиции реакцию прекращают, добавляя 2 см3 5%-ного раствора метафосфорной кислоты. Одновременно готовят контрольные пробы. Для этого в конические колбы вносят 2 см3 суспензии, 2 см3 5%-ной метафосфорной кислоты и в последнюю очередь - 2 см3 аскорбиновой кислоты. Остаток неокисленной аскорбиновой кислоты титруют 0,001 н. раствором йодата (1 см3 0,001 н. KJO3 равен 0,088 мг аскорбиновой кислоты). В последнем случае титрование ведут до появления синей окраски в присутствии кристаллика (5-10 мг) KJ и нескольких капелек крахмала. Активность фермента (А), выраженную в миллиграммах окисленной аскорбиновой кислоты на 1 г сырой ткани, вычисляют по формуле:х (а-в)-Т-у,
V, н
где а - количество см3 0,001 и. раствора 2, 6-дихлорфенолиндофенола (или йодата), израсходованного на титрование контрольной пробы;
в - число см3 0,001 и. раствора 2, 6-дихлор- фенолиндофенола (или йодата), израсходованного на титрование опытной пробы;
Т - титр краски (или йодата);
v1 - общий объем вытяжки;
v2 - объем вытяжки, взятой для титрования;
н - навеска вещества (в г ).
Для пересчета на 100 мг белка производят определение белкового азота в листьях.
Литература
1. Ермаков А.И., Арасимович В.В., Смирнова-Иконникова М.И., Ярош Н.П., Луковникова Г.А. Методы биохимического исследования растений. Л.: Изд-во Колос, 1972. С. 49-50.
Еще по теме ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ АСКОРБИНАТОКСИДАЗЫ:
- Выделение легкорастворимых и ионосвязанных пероксидаз и определение их активности
- Колориметрический метод определения активности пероксидазы (по А.М. Бояркину)
- Определение. Релаксация (от лат. Relaxatio - расслабление), метод консультирования использующий техники изменяющие психофизиологическую активность человека.
- Факт смерти лица в определенное время и при определенных обстоятельствах
- В частности, определение договора лизинга в основном приведено в соответствие с определением,
- Метод 2. «Определение убеждений»Техника 1. «Определение ожиданий»
- Само по себе определение права через свободу еще не преодолевает главного недостатка других определений права -
- Термины даются на русском, английском и датском языках (в указанной последовательности). Цифры в скобках указывают номера определений, от которых зависит данное определение.
- 24.Определенный интеграл как предел интегральной суммы. Свойства определенного интеграла.
- Ж) Лишение права занимать определенные должности или заниматься определенной деятельностью (дисквалификация)
- § 4. Лишение права занимать определенные должности или заниматься определенной деятельностью
- 95 Проблема источника активности мышления.
- Лишение права занимать определенные должности или заниматься определенной деятельностью
- _ 2. Лишение права занимать определенные должности или заниматься определенной деятельностью
- 16 Активные счета
- Методы управления активностью объекта
- § 3. Лишение права занимать определенные должности или заниматься определенной деятельностью