ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИТАМИНА СВ ОКРАШЕННЫХ ОБЪЕКТАХ (по Бекеру)

Принцип метода: 2,5-динитрофенилгидразин с дегидроаскорбиновой кислотой дает соединение, образующее с серной кислотой осадок красного цвета, интенсивность которого измеряют фотометрически.

Реактивы и аппаратура

1. 2%-ная щавелевая кислота (С2О4Н2).

2. Ацетатный буферный раствор, pH 5,4, который смешивают с 2%-ной щавелевой кислотой в отношении 2:1 и разбавляют водой 1:1.

3. 2,6-дихлорфенолиндофенол - ДИФ (0,2 г растворяют в 1000 см³ во­ды, сосуд хорошо закрывают и хранят в холодильном шкафу).

4. Уксусноамиловый эфир или хлороформ.

5. 10%-ный раствор тиомочевины в водном спирте 1:1 (раствор неус­тойчив).

6. 2,4-динитрофенилгидразин - ДФГ (3 г растворяют в 100 см³ 9 и. сер­ной кислоты и фильтруют; устойчив около 4 недель).

7. 85%-ная серная кислота.

8. L-аскорбиновая кислота - АК (приготовляют стандартный раствор для построения кривой растворением 0,60 г аскорбиновой кислоты в

200 см³ 2%-ного раствора щавелевой кислоты).

9. Центрифуга, объем пробирок 50 и 100 см³.

10. Баня со льдом.

11. Гомогенизатор.

Ход анализа

Растительный материал измельчают под углекислым газом. Затем берут определенную навеску, в которой должно содержаться около 5 мт аскор­биновой кислоты, смешивают со 120 см³ 2%-ной щавелевой кислоты, го­могенизируют (2 минуты при 4 тыс. об/мин) и после тщательной промывки стакана и ножа 2%-ной щавелевой кислотой доводят до определенного объема. Экстракт взбалтывают и после центрифугирования берут пипеткой 5 см³ прозрачного раствора в другую центрифужную пробирку, в которую уже заранее налито 12 см³ ДИФ; спустя полминуты - 10 см³ хлороформа и взбалтывают до тех пор, пока лишняя краска не перейдет в органический растворитель, который после центрифугирования удаляют. Из водной фазы пипеткой берут в два стаканчика по 4 см³ жидкости, туда же добавляют 1 см³ ДФГ и каплю раствора тиомочевины; пробу ставят для реакции в тер­мостат на 75 минут при 50°. Второй химический стакан обрабатывают точ­но так же, но без добавления ДФГ. После охлаждения в ледяной бане до­бавляют еще 5 см³ 85%-ной серной кислоты и спустя час измеряют экс­тинкцию при 540 нм. Незадолго до того во второй стакан добавляют 1 см³ ДФГ.

Для построения калибровочной кривой из стандартного раствора, со­держащего 30 мкг АК в 1 см³, берут 5 проб. В первую добавляют 1 см³ рас­твора аскорбиновой кислоты + 4 см³ 2%-ной щавелевой кислоты, что со­ставляет 30 мкг на 5 см³, затем в последующие приливают по 2 см³, 3 см³,

4 см³, 5 см³ аскорбиновой кислоты и щавелевой кислоты так, чтобы общий объем раствора в каждой пробирке составлял 5 см³. Затем пробы просмат­ривают на фотоэлектроколориметре и строят калибровочный график.