Колориметрический метод определения активности пероксидазы (по А.М. Бояркину)

Метод основан на определении скорости реакции окисления бензидина до образования синего продукта окисления определённой концентрации, заранее устанавливаемой на фотоэлектроколориметре [1].

Реактивы и аппаратура

1. Ацетатный буфер с pH 5,4.

2. Раствор бензидина на ацетатном буфере (в мерную колбу на 200 см³ наливают примерно 100 см³ дистиллированной воды, прибавляют 2,3 см³ ледяной уксусной кислоты и 184 мг бензидина; колбу нагревают на водя­ной бане при 60°С, постоянно взбалтывая; после полного растворения бен­зидина в колбу добавляют 5,45 г уксуснокислого натрия, охлаждают и до­водят водой до метки).

3. 0,3%-ная перекись водорода.

4. Фотоэлектроколориметр.

Ход анализа

Навеску растительного материала массой 200-500 мт тонко растирают в фарфоровой ступке с водой или ацетатным буфером с pH 5,4 и переносят в мерную колбу на 50 см³. После 10 минут настаивания вытяжку центрифу­гируют при 4000 об/мин. Для измерения активности лучше брать такое разведение вытяжки, чтобы изменение окраски происходило за 20-60 с. В две кварцевые кюветы с рабочей длиной 20 мм приливают по 2 см³ фер­ментной вытяжки или центрифугата, 2 см³ буферного раствора и 2 см³ бен­зидина. Кюветы в фотоэлектроколориметре располагают против свето­фильтров. Измерение проводят с использованием красного светофильтра при 590 нм в следующей последовательности. В начале с помощью левого барабана устанавливают стрелку гальванометра на нуль, затем правым ба­рабаном переводят стрелку гальванометра в крайнее левое положение (D = 0,125 или 0,250). После этого в контрольную правую кювету приливают 2 см³ воды, а в левую опытную (измерительную) - 2 см³ 0,3%-ной переки­си водорода из пипетки с широким отверстием. С внесением первой капли перекиси водорода включают секундомер. Стрелка гальванометра начина­ет отклоняться от края шкалы к нулевому делению. Секундомер останав­ливают, когда стрелка гальванометра достигает нулевого деления.

По найденной скорости реакции вычисляют активность А фермента :

где D - оптическая плотность, равная 0,125 или 0,250;

а - отношение количества жидкости, взятой для приготовления вы­

тяжки, к массе сырой ткани, см³/г;

б - степень дополнительного разведения вытяжки после центрифуги­рования;

в - степень постоянного разведения вытяжки в реакционной смеси в кювете;

с - толщина слоя (2 см); t - время, с.

Литература

1. Ермаков А.И., Арасимович В.В., Ярош НАЛ, Перуанский Ю.В., Луковнико­ва Г.А., Иконникова М.И. Методы биохимического исследования растений. Л.: Агропромиздат, 1987. С.41-43.