КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ АСКОРБИНОВОЙ, ДЕГИДРОАСКОРБИНОВОЙ И ДИГЕТОГУЛОНОВОЙ КИСЛОТ В РАСТИТЕЛЬНЫХ ТКАНЯХ

Аскорбиновая кислота (АК) - легкоокисляемое соединение, окисление ее идет до дегидроаскорбиновой кислоты (ДАК), лактоновое кольцо кото­рой легко гидролизуется с образованием кислоты с открытой цепью - диге- тогулоновой кислоты (ДКГК).

Метод количественного определения данных кислот основан на взаи­модействии 2,4-динитрофенилгидразина с ДАК и ДКГК с образованием в серной кислоте соответствующих азазонов. Азазоны ДАК и ДКГК дают красное окрашивание, используемое для фотометрического определения.

Для нахождения суммы всех кислот АК окисляют раствором 2,6- дихлорфенолиндофенола до ДАК и содержание восстановленной формы АК определяют по разности.

При раздельном определении ДАК и ДКГК смесь подвергают действию восстановителей, при этом восстанавливаться в АК может только ДАК. В.В. Соколовский, Л.В. Лебедева, Т.Б. Лиэлуп [1] в качестве восстановите­ля предложили использовать унитиол (димеркаптопропансульфонат на­трия), что значительно упростило процедуру восстановления. При pH 7 унитиол в течение 10 минут восстанавливает ДАК в АК. Данные авторы описали методику определения АК, ДАК и ДКГК в животных объектах, описанный метод был несколько видоизменен для анализа растительного материала (Г. Н. Чупахина).

Реактивы

1. 2%-ный раствор 2,4-динитрофенилгидразина в 9 и. серной кислоте, содержащей 0,25% тиомочевины. Для приготовления 100 мл реактива рас­считать, какое количество концентрированной серной кислоты необходимо взять с учетом ее концентрации и плотности, чтобы конечный раствор был 9 и. Например, исходный раствор концентрированной серной кислоты 95,6% и плотность его 1,830. В этом случае необходимо взять 25,2 мл ки­слоты. В кислоте при нагревании или встряхивании растворить 2 г 2,4- динитрофенилгидразина, а затем 0,25 г тиомочевины. Полученный раствор смешать с нужным объемом воды, наливая кислотный раствор в воду так, чтобы конечный объем равнялся 100 мл.

2. 5%-ная метафосфорная кислота (хранить в холодильнике не более двух недель).

3. 85%-ный раствор серной кислоты (в 100 мл дистиллята влить 900 мл концентрированной серной кислоты).

4. 2' 10"³ М унитиол (0,84 мл 5%-ного раствора ампулированного препа­рата в 100 мл фосфатного буфера 0,2 М, рН=7). Раствор хранить не более суток.

5. 0,001 н. раствор 2,6-дихлорфенолиндофенола (краска Тильманса). Хранить в темноте не более одной недели.

Ход анализа

Навеску листьев (около 0,5 г) залить в фарфоровой ступке 10 мл 5%- ной метафосфорной кислоты, растереть. Гомогенат количественно перене­сти в мерную колбу на 25 мл, объем довести до метки метафосфорной ки­слотой; после встряхивания центрифугированием отделить осадок (20 ми­нут при 3000 об/мин).

В две градуированные пробирки с притертыми пробками налить по 1,5 мл полученной вытяжки и в одну из них прибавить по каплям 0,001 и. рас­твор 2,6-дихлорфенолиндофенола до появления слабо-розового окрашива­ния, устойчивого в течение 30 секунд.

В третью пробирку налить 1,5 мл вытяжки, приготовленной на 2‘10"³ М растворе унитола. Данная вытяжка готовится следующим образом: навеска листьев (около 0,5 г) растирается с раствором унитиола, переносится в мерную колбу на 25 мл, объем доводится до метки раствором унитиола, приготовленным на фосфатном буфере. Содержимое колбы встряхнуть, колбу поместить в холодильник на 10 минут - это время необходимо для восстановления ДАК в АК. Центрифугированием отделить осадок. Белки, находящиеся в вытяжке, осаждаются метафосфорной кислотой: к 16 мл центрифугата прибавить 4 мл 5%-ной метафосфорной кислоты, выпавшие в осадок белки удалить центрифугированием (15 минут, 3000 об/мин).

Во все три пробирки прибавить по 0,5 мл 2,4-динитрофенилгидразина и довести объем до 2,5 мл дистиллированной водой. Пробирки поместить в термостат на 20 минут при температуре 100°С. По истечении указанного времени пробирки перенести в ледяную баню и в каждую из них добавить по 2,5 мл (тремя порциями) серной кислоты.

Через час окрашенные растворы фотометрируют при длине волны 520 нм в кювете на 10 мм по сравнению с контрольным раствором, кото­рый готовится и обрабатывается как опытные, только вместо вытяжки ис­пользуется раствор 5%-ной метафосфорной кислоты. По калибровочной

кривой определяют, какой концентрации кислоты соответствует данная оптическая плотность.

Содержание кислоты Хна 1 г навески определяется по формуле:

где С - концентрация раствора кислоты, соответствующая данной оптиче­ской плотности, мкг/мл;

и - навеска растительного материала, г;

25 - общий объем исследуемого раствора, мл;

1,5 - объем раствора, взятый для анализа, мл.

Количественное содержание кислот далее рассчитывается следующим образом. В пробирке с экстрактом, полученным с унитиолом, определяется только ДКГК, так как унитиол восстанавливает ДАК в АК, которая с 2,4-динитрофенилгидразином не определяется. В данную величину необ­ходимо ввести поправку на разбавление за счет использования метафос- форной кислоты для осаждения белков: полученный результат нужно уве­личить на 20%.

В пробирке с кислотным экстрактом определяется ДАК и ДКГК, по­этому, вычтя из данной суммы количество ДКГК, найдём величину ДАК.

В пробирке с кислотным экстрактом, где АК была окислена 2,6-дихлорфенолиндофенолом до ДАК, определяется сумма трех кислот (АК, ДАК и ДКГК). Зная значение ДАК и ДКГК, находим по разности ве­личину АК.

Построение калибровочной кривой

Для построения калибровочной кривой готовят три раствора аскорби­новой кислоты в 5%-ной метафосфорной кислоте:

1- й раствор - 100 мт АК в 250 мл метафосфорной кислоты;

2- й раствор - 0,5 мл 1-го раствора + 9,5 мл метафосфорной кислоты;

3- й раствор - 0,5 мл 2-го раствора + 4,5 мл метафосфорной кислоты.

Определенные объемы 1-го и 2-го растворов (1 мл, 0,75 мл, 0,5 мл,

0,25 мл - 2-го раствора и 1 мл, 0,5 мл - 3-го раствора), содержащие от 20 до 2 мкг АК, доводятся метафосфорной кислотой до 1,5 мл. В качестве кон­троля берется 1,5 мл кислоты.

Во все пробирки по каплям добавляется 0,001 и. раствор 2,6-дихлор фенолиндофенола до появления слабо-розового окрашивания, устойчивого в течение 30 секунд (АК перейдет в ДАК). Затем вносится по 0,5 мл рас­твора 2,4-динитрофенилгидразина и объем доводится до 2,5 мл дистилли­рованной водой. Дальше пробы обрабатываются по прописи, данной в раз­деле “ход анализа”.

С использованием показаний оптической плотности для растворов ДАК разной концентрации, полученных с помощью фотоэлектроколориметра, строится калибровочная кривая.

Литература

1. Соколовский В.В., Лебедева Л.В., Лиэлуп Т.Б. О методе раздельного опре­деления АК, ДАК, и дикетогулоновой кислот (ДКГК) в биологических тканях. // Лабораторное дело. №3. 1974.