ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧИСЛА ХЛОРОПЛАСТОВ, КОЛИЧЕСТВА КЛЕТОК И ИХ ОБЪЕМА В ФОТОСИНТЕЗИРУЮЩИХ ТКАНЯХ

Данные показатели определяются по методу А.Т. Мокроносова и Р.А. Борзенковой [1].

Пробы для измерений отбираются с помощью пробочных сверл с из­вестным диаметром. В любом случае желательно иметь данные о собст­венном возрасте листа и площади листовой пластинки.

Подсчет числа клеток, числа хлоропластов в клетке, определение раз­мера клеток проводится на листьях,фиксированных в 70%-ном этаноле. В этом случае пробы могут хранится в холодильнике в течение 3-4 месяцев.

Количество клеток фотосинтезирующих тканей (тыс/см²)

Для определения числа клеток в единице площади листья фиксируют этанолом. Одна проба включает 5 дисков диаметром 9,8 мм (сверло №4, общая площадь 3,8 см²).

Подсчет числа клеток производят в суспензии после предварительной мацерации тканей. Для получения суспензии пробирки с дисками, куда приливают 1 мл раствора НС1, помещают на водяную баню. Условия маце­рации тканей подбирают для каждого объекта. Мацерация для подавляю­щего числа растений производится 0,5 -1,0 н. НС1 при 60 - 100°. Некоторые объекты (например, осоки и злаки) требуют более жестких условий маце­рации, и концентрация НС1 может увеличиваться до 5,0 н. Время мацера­ции 10-30 мин. Затем объем доводят водой до 5 мл и пробирку тщательно взбалтывают до получения однородной суспензии. Следует иметь в виду, что слишком жесткие условия мацерации могут привести к разрушению клеток.

Самый простой подсчет - определение общего количества клеток в ка­мере. Он производится при отсутствии дифференцировки листа на пали­садную и губчатую ткани. Если лист дифференцирован, возможны сле­дующие случаи.

1. На поперечном срезе листа видна резкая грань между палисадной и губчатой тканью, и клетки этих тканей отличаются по форме. В суспензии подсчитывают (отдельно) палисадные и губчатые клетки. Для проверки нужно подсчитать общее число клеток. Если установлено, что сумма губ­чатых и палисадных клеток, полученная путем сложения, равна или близка к общей сумме клеток, полученной при подсчете, то в дальнейшем подсчет общего числа клеток можно не производить.

2. Палисадная и губчатая ткани имеют резкую грань, но по форме клет­ки мало отличаются друг от друга. В суспензии трудно различить палисад­ные и губчатые клетки. В этом случае на поперечном срезе определяют ко­личественное соотношение палисадных (П) и губчатых (Г) клеток. Затем в суспензии подсчитывают количество клеток. Зная отношение П/Г, можно определить количество палисадных и губчатых клеток в суспензии.

3. Палисадная и губчатая ткани не имеют определенной грани: пали­садная ткань постепенно переходить в губчатую и, следовательно, имеется слой клеток, которые можно отнести и к палисадной, и к губчатой ткани. Здесь неизбежна условная граница между тканями или выделение третьего промежуточного слоя. Как во втором случае, определяют соотношение П/Г и вычисляют количество клеток разных тканей.

Следовательно, прежде чем приступить к мацерации, необходимо при­готовить поперечный срез листа и тщательно изучить степень дифферен­цировки тканей.

При подсчете клеток следует учитывать только хлорофиллоносные клетки и не принимать во внимание клетки эпидермиса, волосков, сосуди­сто-волокнистых пучков и других тканей. Если условия мацерации ткани выбраны верно и получена однородная суспензия, подсчет клеток будет зависеть от тщательного перемешивания суспензии перед взятием пробы и правильного притирания стекла в камере. Анатомический анализ на многих видах растений показал, что при подсчете клеток в камере наибо­лее часто встречающийся коэффициент вариации (V%) равен 20%. За счет тщательности работы наблюдателя коэффициент можно снизить до 10-15%.

Если V% = 20, то для определения среднего значения необходимо под­считать количество клеток не менее чем в 16 камерах при заданной ошибке (Sx %) 10% при р = 0,95 и не менее чем в 27 камерах при р = 0,99.

Для пересчета количества клеток в тыс./см² нужно умножить среднее значение числа клеток в полном объеме камеры Фукса - на коэффициент

К= 411, камеры Горяева - на коэффициент К=1462. Эти коэффициенты справедливы для условий, когда проба листьев имеет площадь 3,8 см², а объем суспензии - 5 мл.

Объем клеток (тыс. мкм³)

Суспензия клеток используется для определения размеров клеток пали­садной ткани, имеющих форму цилиндра или эллипсоида. Как показывают специальные исследования, мацерация фиксированной этанолом ткани практически не влияет на размер клеток. Например, измерение палисадных клеток табака на поперечном и тангентальном срезах свежих листьев дало значение: L=117,6 мкм, £>=34,7 мкм (среднее из 100 измерений). Изме­ряя клетки в суспензии после мацерации, получили близкие значения: £=111,4 мкм, D =35,4 мкм.

Для измерения клеток каплю суспензии помещают на предметное стек­ло и осторожно закрывают покровным. На покровное стекло не давят. Па­лисадные клетки фотографируют при увеличении 15x10 или 15x20 (в зави­симости от размера). При этом же увеличении фотографируют шкалу объ­ект-микрометра. Полученные негативы проектируют на экран фотоувели­чителя и с помощью линейки объект-микрометра измеряют длинную (£) и короткую (£>) оси клеток, включая клеточную оболочку.

где К - поправочный коэффициент, величина которого меняется в зависи­мости от соотношения L/D.

Эти коэффициенты эмпирически найдены Ю.Л. Цельникер и имеют следующие значения:

При отношении L/D больше 5 поправочный коэффициент можно не вносить, так как клетка может быть принята за цилиндр. При отношении L/D меньше 2,5 объем клетки целесообразно определять по формуле эл­липсоида вращения:

Средний объем клеток можно рассчитывать двумя путями.

1. Определяется объем каждой отдельной клетки и затем вычисляется

средний объем.

2. Объем вычисляется по средним значениям L и D. Такой способ рас­чета проще, но ошибка найденного среднего объема клеток увеличивается, так как он определяется по формуле произведения средних.

При определении средних значений L и D V% = 15 - 20. Измеряя 50 - 100 клеток при V% =15 -20, имеем Sx % не более 5% при р = 0,95.

Большую трудность вызывает измерение объема клеток в губчатой тка­ни, так как у многих объектов эти клетки имеют неправильную форму.

1. Делают и фотографируют тангентальный срез с нижней поверхности листа. Снимки проецируют на экран и определяют площадь контуров

50 - 100 клеток. Затем, пользуясь объект-микрометром, измеряют высоту клетки на поперечном срезе. Объем определяют по произведению площади проекции клетки на высоту.

2. Получив серию снимков поперечных и тангентальных срезов листа, можно построить объемную модель клетки из пластилина в удобном мас­штабе и определить объем клетки по объему модели, используя при этом удельный вес пластилина. Этот случай оказывается единственно возмож­ным при необходимости определить объем клетки у растений, имеющих очень сложную амебообразную форму клеток (например, у некоторых па­поротников). Ошибка измерений при этом значительна.

Число хлоропластов в клетке

Чаще всего при мацерации тканей хлоропласты в клетке сохраняют свою целостность и можно подсчитать их количество. Если число хлоро­пластов в клетке невелико (до 30), подсчет можно производить в нативной клетке. Если хлоропластов более 30, непременным условием является при­готовление давленых препаратов. Каплю суспензии помещают на пред­метное стекло и закрывают покровным. Небольшого нажатия на покровное стекло достаточно, чтобы хлоропласты в клетке распределились по плос­кости. Клетка при этом изменяет свою форму, но при некотором навыке удается различить палисадные и губчатые клетки.

Применение давленых препаратов повышает скорость и точность изме­рений по сравнению с подсчетом хлоропластов в целых клетках. На давле­ных препаратах обнаруживают на 30-50% больше пластид, чем в целых клетках. Подсчет хлоропластов у объектов с большим числом пластид (150 -300) облегчается, если применять окулярную сетку.

При подсчете хлоропластов нужно быть очень внимательным, так как за хлоропласты можно принять их фрагменты. Разрушение хлоропластов иногда происходит во время приготовления давленых препаратов или при мацерации, если условия мацерации оказываются слишком жесткими, а также при длительном хранении фиксированного материала.

Как правило, клетки палисадной и губчатой ткани существенно отли­чаются по объему и по числу хлоропластов. Поэтому число хлоропластов определяют отдельно в тех и других клетках. В свою очередь среди пали­садных и губчатых клеток вариация по размеру составляет, как указыва­лось, 15-20%, а в некоторых случаях может достигать 30-35%. Поэтому при определении средней величины количества хлоропластов в клетке нужно стремиться к тому, чтобы при подсчете в поле зрения микроскопа попадали разные по величине клетки. В противном случае можно получить искаженный результат.

Средний коэффициент вариации числа хлоропластов в клетке 25-30%. Для определения среднего значения числа хлоропластов в клетке при р = 0,95 и Sx % =10 нужно произвести подсчет не менее чем в 25 - 35 клетках, а при Sx % = 5 в 100 - 140 клетках.

Литература

1. Мокроносов А.Т., Борзенкова Р.А. Методика количественной оценки структуры и функциональной активности фотосинтезируемых тканей и органов // Труды по прикладной ботанике, генетике и селекции. 1978. Т.61. Вып. 3. С.119-133.