КОЛОРИМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ АСКОРБИНОВОЙ КИСЛОТЫ (по Г.Н. Чупахиной)

При количественном определении аскорбиновой кислоты в растениях широко распространенным методом титрования растительных вытяжек

2,6- дихлорфенолиндофенолом имеются некоторые трудности, связанные с определением конца титрования.

Предлогаемый нами метод основан на фотометрическом определении избытка 2,6-дихлорфенолиндофенола после восстановления определенной части его аскорбиновой кислотой. Оптическая плотность окрашенного рас­твора измеряется с помощью фотоколориметра строго через 35 секунд по­сле добавления в растительную вытяжку краски, что дает возможность полностью исключить ошибки, возможные при титрационном определении аскорбата.

Ход определения

Для количественного определения восстановленной аскорбиновой ки­слоты берется навеска свежего растительного материала - около 2 грам­мов. Навеска измельчается ножницами из нержавеющей стали, так как сле­ды тяжелых металлов способствуют окислению аскорбиновой кислоты. Измельченный материал заливается 10 мл 2%-ной метафосфорной кисло­ты и быстро растирается. Гомогенат количественно переносится в мерную колбу на 100 мл, объем доводится до метки раствором 2%-ной метафос­форной кислоты, которая является одним из лучших стабилизаторов ас­корбиновой кислоты в растворе, к тому же она осаждает белки. Содержа­ние колбы встряхивается, фильтруется или центрифугируется. Из фильтра­

та берется три пробы по 10 мл.

Для приготовления раствора краски берётся 0,0625 г 2,6- дихлорфенолиндофенола, навеска переносится в мерную колбу на 250 мл, куда приливается 150-200 мл теплой дистиллированной воды и 6 капель 0,01 и. щелочи. Колба встряхивается в течение 10-15 минут до полного растворения краски; после того как содержимое колбы примет комнатную температуру, раствор доводится до метки водой и взбалтывается.

Как только к пробе прилита краска, включается секундомер. Расти­тельная вытяжка с краской хорошо перемешивается, раствор заливается в кювету толщиной 10 мм. Кювета вставляется в держатель кювет колори­метра, нулевая точка которого предварительно устанавливается по 2%-ной метафосфорной кислоте. При колориметрировании вытяжки с краской не­обходимо стрелку гальванометра постоянно подводить к нулю, пока не пройдет 35 секунд, так как интенсивность окраски раствора все время уменьшается. Этого времени достаточно, чтобы выполнить вышеописан­ные операции. Фотометрирование ведется при 530 нм (зеленый свето­фильтр). Параллельно колометрируется 10 мл 2%-ной метафосфорной ки­слоты с 1 мл краски (контроль). Изменение в интенсивности окрашивания контрольного и опытного образца пропорционально количеству аскорби­новой кислоты, находящемуся в растительной вытяжке. Расчет произво­дится по калибровочной кривой.

Для построения калибровочной кривой 100 мт аскорбиновой кислоты растворяется в 1 л 2%-ной метафосфорной кислоты. Из данного раствора готовятся разведения, содержащие 1, 2, 3 мкг и т. д. аскорбиновой кислоты в 1 мл. По разнице в колориметрировании раствора 2%-ной метафосфор­ной кислоты и стандартных растворов строится калибровочная кривая.

В том случае, когда вытяжка растений содержит значительное количе­ство аскорбиновой кислоты (около 700 мкг на 1 г), при добавлении 1 мл краски к 10 мл вытяжки краска полностью обесцвечивается аскорбиновой кислотой. В этом случае вытяжку необходимо разбавить вдвое 2%-ной ме­тафосфорной кислотой и учесть это при расчете содержания аскорбиновой кислоты.

Вычисление результатов

Содержание аскорбиновой кислоты на 1 г исследуемого материала вы­числяется по формуле:

где а - содержание аскорбиновой кислоты в 1 мл вытяжки, найденное по калибровочной кривой в мкг;

V - объем экстракта, полученного из данной навески; g - навеска исследуемого материала в граммах.

Определение содержания аскорбиновой кислоты в растениях данным методом так же, как и титрационным, для некоторых объектов дает завы­шенные результаты по сравнению с хромотографическим определением, так как краской оттитровывается не только аскорбиновая кислота, но и не­которые близкородственные соединения, находящиеся в экстракте. Однако благодаря своей простоте, хорошей повторяемости результатов этот метод [1] может быть использован для массовых определений витаминной цен­ности растений, для сравнительного определения содержания аскорбино­вой кислоты, а также для количественного определения аскорбиновой ки­слоты, выделенной хромотографическим методом.

Аскорбиновая кислота является легкоокисляющимся соединением. При количественном ее определении необходимо иметь в виду, что свет уско­ряет окисление аскорбиновой кислоты даже в присутствии стабилизирую­щих веществ, поэтому все операции по растиранию, фильтрованию и ко- лориметрированию лучше вести на неярком свету и по возможности быст­ро.

Литература

1. Чупахина Г.Н. Колориметрическое определение аскорбиновой кислоты // Специальный практикум по биохимии и физиологии растений /Под ред.

М.М. Окунцова. Калининград, 1981. С. 14-16.