СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

Растение является довольно трудным объектом для исследования нук­леиновых кислот, тем не менее в настоящее время имеется немало методов их количественного определения в различных тканях, которые позволяют определять РНК и ДНК в одной навеске [1].

Предварительное удаление пигментов, кислоторастворимого и липид­ного фосфора является непременным условием спектрофотометрического определения фосфора РНК и ДНК.

Ход работы

Для определения содержания нуклеиновых кислот навеску исследуемо­го материала (5 - 7 г) помещают в широкую пробирку и заливают 10-15 мл 0,5 и. НСЮ4, охлажденной до 0°С. Пробирку с навеской помещают в криогидратную смесь для фиксации. После фиксации навеску с НСЮ4 пе­реносят в фарфоровую ступу, тщательно растирают стеклянным песком до гомогенного состояния и прокачивают на ротаторе 30 минут при понижен­ной температуре. Полученный гомогенат центрифугируют в течение 5 ми­нут при 3000 об/мин. Экстракт сливают и ставят в холодильник. Осадок заливают 10 мл 0,5 и. НСЮ4 и прокачивают еще 30 минут при 0°С, а затем центрифугируют при тех же условиях. Экстракты объединяют в мерной колбе или цилиндре, а осадок трижды промывают холодной дистиллиро­ванной водой. Промывные воды объединяют с кислотными экстрактами, немедленно нейтрализуют 0,2 и. NaOH по фенолфталеину и доводят до оп­ределенного объема. Образующиеся хлопья натриевой соли хлорной ки­слоты удаляют центрифугированием. Нейтрализованный хлорнокислый экстракт может быть использован для определения свободных адениловых нуклеотидов.

Остаток после удаления кислоторастворимого фосфора трижды обра­батывают 96%-ным этанолом на холоде. Затем проводят многократную экстракцию смесью этанол-серный эфир (3:1) при комнатной температуре до полного извлечения пигментов.

Остаток после извлечения кислоторастворимого и липидного фосфора заливают 0,5 и. КОН (или NaOH) из расчета 10 мл щелочи на 100 мг остат­ка и выдерживают при 37° С в течение часа. Затем охлаждают и центрифу­гируют 15 минут при 4000 об/мин. Надосадочную жидкость сливают и ста­вят в холодильник, а осадок после промывания холодным 0,5 и. КОН от­брасывают. Прозрачные центрифугаты объединяют и нейтрализуют на ле­дяной бане холодной 57%-ной НСЮ₄ по фенолфталеину. Затем концентра­цию раствора этой кислоты доводят до 5% ее содержания. На холоде вы­падает осадок ДНК, а в растворе остается РНК. Через 20 минут осадок от­деляют центрифугированием и два раза (по 5 мл) промывают охлажденной 5%-ной НСЮ₄. Центрифугаты, содержащие РНК, объединяют в кониче­ской колбочке на 50 мл, закрывают обратным воздушным холодильником и гидролизуют на кипящей водяной бане в течение 15 минут. Затем охлаж­дают и фильтруют через стеклянный фильтр №4 или через обеззоленный “мелкопористый” фильтр. Объем прозрачного фильтрата измеряют и ис­пользуют для спектрофотометрического определения фосфора РНК.

Осадок ДНК с помощью 5%-ной HCIO4 переносят в коническую кол­бочку на 50 мл, закрывают обратным воздушным холодильником и гидро­лизуют 30 минут на кипящей водяной бане. После охлаждения и центри­фугирования жидкость сливают в мерную колбочку, а осадок промывают небольшим количеством 5%-ной НСЮ4, центрифугируют и надосадочную жидкость присоединяют к первому центрифугату, объем доводят до метки или просто измеряют. Прозрачный раствор спектрофотометрируют. В ка­честве контроля, против которого измеряют оптическую плотность опыт­ного раствора, берут 5%-ный раствор НСЮ₄. Оптическую плотность полу­ченных опытных растворов измеряют при 270 и 290 нм.

Вычисление концентрации фосфора нуклеиновых кислот (2Q произво­дят по формуле:

_х=^Е27О~Е₂₉о_мг/

190

где Е - оптическая плотность растворов при соответствующей длине вол­ны. Деление на 190 дает количество фосфора нуклеиновой кислоты в 1 мл раствора.

Пример расчета

При спектрофотометрировании раствора РНК найдена Е₂7о = 836, а Е₂9о = 506. Объем раствора РНК составлял 100 мл. Перед определением оптиче-

ской плотности он был разбавлен в 3 раза. Навеска растительного материа­ла в пересчете на сухой вес 0,5 г. Количество фосфора РНК будет:

Литература

1. Окунцов М.М.,. Боровик З.И., Гребенников А.С. и др. Специальный практи­кум по биохимии и физиологии растений. Калининград, 1981. С.8-10.