Элементарный акт функционирования АТРсинтазы

Научная общественность встретила без энтузиазма первую ста­тью Митчелла [59], посвященнуго хемоосмотической гипотезе. Только после публикации в 1966 блестящих экспериментов по образованию АТР после быстрого скачка pH [63] хемоосмотическая гипотеза была почти единодушно принята специалистами.

Только одно заемное облако портило этот прекрасный ландшафт. Митохондрия — это вывернутый наизнанку тилакоид хлоропластов.

Согласно концепции Митчелла синтез АТР в условиях, аналогич­ных опытам Ягендорфа и Юрайба, требует не повышения, а скач­кообразного понижения pH. Такие опыты были проведены во многих лабораториях сразу после публикации работы Ягендорфа и Юрайба, но безуспешно.

В нашей лаборатории были пост авлены специальные экспери­менты (все ссылки на эти работы и на опыты, выполненные затем в других лабораториях можно найти в [1, 31,4Ї,61]). Было показано, что в экспериментах [64] дополнительное количество АТР образуется на стадии предварительного повышения: pH от 7,0 до 9,0, а не на стадии последующего понижения pH. Митохон дрии, таким образом, требуют тот же знак ДрН, что и хлоропласты.

Первые эксперименты были поставлены нами с сопряженными и разобщенными митохондриями. Основные результаты: сопряжен­ные митохондрии способны осуществлять количественный синтез АТР в ответ на быстрое повышение pH. В расчете на одну ЦЭТ один pH скачок приводит к образованию от двух до пяти (в зависимости от пре­парата) молекул АТР. Обязательным условием является пересечение во время скачка значения pH ~ 8,2. Те же результаты были получены с разобщенными митохондриями, не способными к окислительно­му фосфорилированию. На рис. 4.25 о приведена экспериментальная зависимость выхода АТР при быстром повышении pH в суспензии ра­зобщенных митохондрий печени крысы от конечного значения pH при фиксированном начальном (кривая 1) и от начального значения pH при фиксированном конечном (кривая 2). Эти зависимости соответ-

Рис.

ствуют кривым титрован мя кислотных групп с рК « 8,2. Индуцируемое скачком pH образование АТР не нуждается в функционировании ЦЭТ, полностью блокируется ингибиторами АТРсинтазы. Синтез АТР не на­блюдается в отсутствии субстратов фосфорилирования. При избытке субстратов фосфорил ирования можно таким способом получить с од­ним и тем же образцом множество молекул АТР в расчете на одну ЦЭТ, меняя попеременно pH, например, от 7,5 до 8,5 и обратно. АТР образуется только на стадии повышения pH.

Если ADP и pj добавляют после «правильного» скачка pH, то вы­ход АТР зависит от промежутка времени между скачком pH и добавкой. Для митохондрий время релаксации Ту₂, т.е. интервал времени, после которого выход АТР уменьшается наполовину, составляет при комнат­ной температуре около 10 с. Изолированные АТРсинтазы (см. ниже) релаксируют быстрее.

Образование АТР в ответ на быстрый скачок pH наблюдали также с мембран связанными АТРазами без замкнутых везикул (рис. 4.25 б). Для осуществления элементарного акта синтеза АТР после скачка pH не нужны ни замкнутые везикулы, ни даже фрагменты мембран. Ре­зультаты, аналогичные описанным выше, были получены также с изо­лированными растворимыми компонентами АТРаз животных, бактери­альных и растительных клеток. Этот эффект является общим свойством не только АТРаз из трансформирующих энергию мембран, но и других

АТРаз, нормальное функционирование которых не сопровождается образованием АТР, например АТРаз миозина, нитрогеназы и др.

В рамках описанного выше релаксационного механизма фермен­тативного катализа энергодонорной реакцией, сопряженной с энерго­акцепторной стадией синтеза АТР, является акт диссоциации опреде­ленной кислотной группы (или групп) в каталитической части АТР­синтазы.

Рассмотрим теперь структуру АТРсинтазы и попробуем ответить на главный вопрос: какая стадия процесса образования АТР в водной фазе является энергоакцепторной?

На рис. 4.26 представлена упрощенна^ схема АТРсинтазы. Струк­тура состоит из двух основных частей: гидрофильного, экспонирован­ного в водную фазу комплекса F! (фактор сопряжения) и гидрофобного фактора F_o, связанного с мембраной.

F_o выполняет роль специфического протонного канала, с по­мощью которого ионы водорода пересекают імембрану. В отсутствие субстратов фосфорилирования утечка протонов из водной фазы через комплекс F_o затруднена. Удаление фактора F,’ делает сопрягающую мембрану прозрачной для ионов водорода: появляется много сквозных дырок. Протоны в этом случае свободно проходят через мембрану, и их концентрации по обе стороны выравниваются. ^;

Фактор сопряжения Fj представляет собой белковый комплекс, содержащий девять субъединиц: три одинаковых о субъединиц, три одинаковых р субъединиц и по одной 7, б и є субъединиц. Все а и р субъединицы расположены вокруг продолговатой 7 субъединицы (рис. 4.26). Фактор Fj имеет вращательную симметрию третьего поряд­ка. Поворот вокруг оси, параллельной 7 субъединице, приводит к сме­щению каждой из а и р субъединиц в положение другой аналогичной субъединицы. 7 субъединица длиной 9 нм слегка изогнута и выступает на 3 нм из гексамера ЗаЗр (рис. 4.26). Субъединиц^ 7 и маленькая субъединица д играют роль мостиков, соединяющих части F_o и F_t АТРсинтазы. Небольшая субъединица є является регулятором фермен­тативной активности. В работах лаборатории Уокера можно найти де­тальное описание компонентов и структуры АТРсинтазы митохондрий.

В 1973-1974 годах две независимые группы ученых из лаборатории Бойера [65,66] и Слэйтера [67-69] предположили, что энергия, посту-

Рис 4 26 Пространственная структура АТРсинтазы

пающая в АТРсинтазу, расходуется главным образом на освобождение прочно связанной молекулы АТР из каталитического центра Fj.

По данным рентгеноструктурноіго анализа, молекулы АТР и ADP связываются между субъединицами а и /3 [73]. Синтез и гидролиз АТР катализируют только ft субъединицы. Молекулы АТР и ADP, связанные с а субъединицами, удерживаются так прочно, что во вре- мя работы фермента практически не обмениваются с молекулам АТР и ADP окружающей среды. Вероятно, эти прочно связанные молекулы не участвуют в синтезе АТР, а выполняют только регуляторные функ­ции. На рис. 4.27 схематически показана последовательность событий

Рис. 4.27. Схема энергозависимых изменения схютояний в ходе синтеза АТР (объяснения в тексте *)

в ходе образования АТР. Первая стадия этого процесса — связывание ADP и р₍. активным центром р субъединицы, находящейся в «откры­том» конформационном состоянии 1.

В водной среде константа равновесия реакции

образование АТР энергетически невыгодно и равновесие реакции сме­щено влево. Здесь и далее нижние индексы s и Ъ означают, соот­ветственно, «в водном растворе» и «связанный с мембраной». При­соединение субстрата (субстратов) фосфорилирования приводит, как всегда после связывания низкомолекулярного лиганда белковой глобу­лой, к возникновению неравновесного состояния Р субъединицы и ее релаксации к «закрытому» состоянию 2. По-видимому, первое предпо­ложение о конформационных изменениях ферментов при мембранном фосфорилировании было опубликовано в 1972 году [70]. Согласно измерениям Бойера, воспроизведенных во многих лабораториях, от­ношение ATP₆/ADP₆ = 1. Это значит, что AG = 0 и образование АТР происходит практически бесплатно. Вновь образованная молекула АТР прочно связана с Р субъединицей, и для ее освобождения в водную среду требуется затратить энергию на конформационную релаксацию субъединицы к «открытому» состоянию (стадия 3). Согласно описан­ным выше экспериментам со скачкообразными повышениями pH, эта последняя стадия начинается с диссоциации некоторых кислотных групп белковой глобулы.