ИССЛЕДОВАНИЕ ИНТЕНСИВНОСТИ ПРОТЕКАНИЯ ПРОЦЕССА ПЕРОКСИДНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ МЕМБРАН

В зависимости от конкретной цели исследований могут быть использованы различные физико-химические методы количе­ственного определения молекулярных продуктов ПОЛ мембран или общей оценки динамики протекания свободнорадикальных процессов окисления.

Так, например, йодометрический- (амперометрический) метод количественной оценки продуктов ПОЛ основан на определении концентрации свободного йода или трийодина, образующихся при восстановлении пероксидных групп йодид-ионом.

К оптическим методам количественного анализа продуктов пероксидного окисления липидов относят целый ряд методов: УФ-спектрофотометрию для обнаружения гидропероксидов, ис­следование уровня гидропероксидов с использованием тиоциа­ната аммония, определение промежуточных продуктов ПОЛ по реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой (ТБК-тест), диеновых конъ­югатов ненасыщенных жирных кислот, флуоресцентный анализ шиффовых оснований — конечных продуктов ПОЛ и др.

Хемилюминесцентные методы, используемые для интеграль­ной оценки процессов ПОЛ, основаны на регистрации оптичес­кого излучения, возникающего в результате спонтанных или ини­циируемых в биологических пробах химических реакций.

Лабораторная работа № 11

Определение уровня продуктов пероксидного окисления липидов мембран с использованием тиобарбитуровой кислоты

В основе метода лежит реакция 2-тиобарбитуровой кислоты (ТБК) с промежуточными продуктами ПОЛ, в результате кото­рой образуется окрашенный триметиновый комплекс с максиму­мом поглощения при 532 нм:

Считают, что главная роль при образовании этого окрашен­ного продукта принадлежит малоновому диальдегиду (МДА).

Материалы и оборудование: тиобарбитуровая кислота, три- хлоруксусная кислота, буферный раствор с pH 7,4 (см.

Ход работы

Тканевой гомогенат или суспензию мембран в буферном ра­створе (pH 7,4) в объеме 2,5 мл поместить в центрифужные про­бирки и добавить 1 мл 17 %-ного раствора трихлоруксусной кис­лоты. Центрифугировать 10 мин при 4000 об/мин. Отобрать на­досадочную жидкость и 2 мл ее перенести в пробирку, в которую налить 1 мл 0,8 %-ного раствора ТБК, и закрыть ее. Пробирку поместить на водяную баню при 100 °С на 10 мин. Затем пробу охладить и зарегистрировать оптическую плотность на фотоэлек­троколориметре КФК-3 при длине волны 532 нм. В качестве кон­троля использовать буферный раствор вместо супернатанта. Ко­личество промежуточных продуктов ПОЛ (МДА) рассчитывают по формуле

где К — количество продуктов ПОЛ; А_о — оптическая плотность опытного раствора; А_к — оптическая плотность контрольного раствора; £ — молярный коэффициент экстинкции, равный в дан­ном случае 1,56-10⁵ моль^-см'¹.

Образование комплекса ТБК—МДА регистрируют также флуо­ресцентным методом. Для этого к 0,1 мл 3%-ного раствора доде- цилсульфата натрия добавляют 1,5 мл 2 моль/л ацетатного бу­фера (pH 3,6) и 0,8%-ного раствора ТБК, доводят бидистиллиро- ванной водой до 4 мл. Полученную смесь инкубируют при 95 °С в течение 60 мин. После охлаждения добавляют 1 мл 0,2 н соля­ной кислоты и 5 мл смеси н-бутанол-пиридин в объемном соот­ношении 15:1 и перемешивают. Центрифугируют 15 мин при 3000 об/мин, отделяют надосадочную жидкость и регистрируют ее спектр флуоресценции в области длин волн 450—600 нм. За­тем определяют интенсивность люминесценции в ее максимуме (=515 нм). Чувствительность метода по стандарту МДА составля­ет 0,5 нмоль при использовании чистых образцов ТБК.

6.4.