ИЗУЧЕНИЕ ИЗМЕНЕНИЙ СТРУКТУРНОГО СОСТОЯНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ МЕМБРАН МЕТОДОМ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ ЗОНДОВ

Современным биофизическим методом исследования, позво­ляющим изучать структурное состояние биомембран, транспорт ионов, трансмембранный потенциал, взаимодействие веществ раз­личной природы с мембранами и другие процессы, признан ме­тод флуоресцентных зондов.

“Универсальным” мембранным флуоресцентным зондом, ре­агирующим на самые разнообразные перестройки, которые мо­гут происходить в мембранах, служит 1-анилинонафталин-8-суль- фонат (АНС):

АНС был первым зондом, который использовал Д. Лоуренс в 1952 г. для исследования мембранных структур. Он является клас­сическим примером зонда, распределяющегося между водной и мембранной фазами в измеримой пропорции. АНС флуоресциру­ет практически только в связанном с мембраной состоянии. При­чем флуоресценция связанного с мембраной красителя заметно отличается по своим характеристикам от его флуоресценции в водной фазе, что позволяет делать заключение о характере мик­роокружения хромофорных групп молекул зонда.

Исследователя, использующего флуоресцентные зонды, инте­ресует положение максимумов их спектров поглощения и флуо­ресценции не только в связи с необходимостью выбора правиль­ных условий возбуждения и измерения флуоресценции, но и по­тому, что величина стоксова сдвига (длинноволновый сдвиг мак­симума флуоресценции по отношению к максимуму поглощения) отражает такое важное свойство среды, как полярность. Величи­на стоксова сдвига определяется следующими условиями:

а) изменением дипольного момента молекулы при переходе из основного в возбужденное состояние;

б) электронной и ориентационной поляризуемостью окружа­ющих зонд молекул.

Спектр поглощения АНС в водном растворе имеет максимум в области длин волн 350—360 нм, а спектр флуоресценции — при 478—480 нм.

При связывании данного красителя мембранами или белками в определенной мере изменяются все параметры поглощения и флуоресценции, так как зонд оказывается в среде менее полярной и менее текучей, чем водный раствор.

Сейчас трудно однозначно ответить на вопрос о локализации АНС в белково-липидных мембранах. Предполагают, что молеку­ла зонда не может глубоко погрузиться в липидный бислой, так как заряженная сульфогруппа должна оставаться на поверхности. Кроме того, горизонтальная ориентация длинной оси его молеку­лы не позволяет погрузить в бислой фенильное кольцо. Скорее всего, в плазматических мембранах часть АНС связана с белками, а часть — с липидами. В пользу этого представления приводят данные о двух компонентах кривой затухания флуоресценции АНС в белково-липидных мембранах, из которых компонента с боль­шим временем жизни преимущественно обусловлена молекула­ми зонда, связанными с белками, а вторая — с липидами.

1-Диметиламино-5-нафталиносульфохлорид (DANS) способен ковалентно присоединяться к свободным аминогруппам и явля­ется хромофором многих флуоресцентных зондов. DANS-глицин имеет следующую структурную формулу:

Аминогруппа DANS-глицина, с одной стороны, сопряжена с я-электронной системой нафталина, а с другой — взаимодейству­ет с растворителями, полностью изменяя как спектр поглощения нафталина, так и его флуоресцентные свойства. При возбужде­нии молекулы аминогруппа поворачивается в одну плоскость с кольцами нафталина, при этом дипольный момент молекулы уве­личивается.

Предполагают, что возбужденная молекула DANS может на­ходиться в двух различных состояниях, различающихся степе­нью чувствительности к полярности микроокружения.

Лабораторная работа № 12

Исследование фотоиндуцированных изменений структурного состояния эритроцитарных мембран методом флуоресцентных зондов

Материалы и оборудование: свежеприготовленные препара­ты мембран эритроцитов человека, 1-анилинонафталин-8-суль- фонат, DANS-глицин, акридиновый желтый, флуоресцеин, NaOH, родамин 6Ж, акридиновый оранжевый, установка для регистра­ции спектров люминесценции.

Ход работы

Для регистрации спектров флуоресценции зондов 1,8-АНС и DANS-глицина в комплексе с нативными и УФ-облученными эрит­роцитарными мембранами необходимо использовать установку, описанную в работе В. Г. Артюхова, О. В. Путинцевой (1996). В ней в качестве источника света применяют ртутную лампу СВД-120. Возбуждающий свет выделяется с помощью светофиль­тра СЗС 7—2 и падает на кювету с исследуемым образцом. Лю­минесценцию растворов зондов измеряют при помощи многохо­довой кварцевой кюветы объемом 4 мл с зеркальными стенка­ми. Регистрируемый свет проходит через монохроматор спект­рофотометра СФ-4А и фиксируется фотоумножителем ФУЭ-18А. Напряжение на ФЭУ составляет 1 кВ. Ширина щели — 1 мм. Сигнал с ФЭУ через входной блок подается на вход программи­руемого цифрового вольтметра В 7-43 и обрабатывается пр встро­енной программе Р4 (“среднее арифметическое из п измерений”).

Для работы необходимо приготовить раствор АНС (препарат фирмы “Sigma”, США) на бидистиллированной воде, имеющий исходную концентрацию 5-Ю'³ моль/л, и спиртовой раствор DANS-глицина (содержание спирта — не более 10 %) с исходной концентрацией 1О '^! моль/л.

Для исследования спектров флуоресценции 1,8-АНС в комп­лексе с суспензией нативных и УФ-облученных мембран указан­ные растворы в объеме 1,5 мл надо проинкубировать с 1,5 мл 1-Ю'¹ моль/л водного раствора АНС при 20 °С в течение 15 мин, затем смесь внести в кювету и зарегистрировать спектр флуорес­ценции в интервале длин волн 430—500 нм.

Для изучения спектров флуоресценции зонда DANS-глицина в комплексе с суспензией нативных и УФ-модифицированных мембран эритроцитов указанные растворы в объеме 1 мл необхо­димо смешать с 0,5 мл раствора зонда и 1,5 мл 10 ммоль/л трис-HCl буфера (pH 7,6 при 20 °С) и инкубировать смесь в тече­ние 15 мин, затем регистрировать спектры флуоресценции в ин­тервале длин волн 500—550 нм.

I вариант

Предварительно зарегистрировать спектры поглощения и флу­оресценции водного раствора зонда 1,8-АНС (контроль). Затем снять спектры люминесценции зонда в присутствии суспензии эритроцитарных мембран с учетом эффекта разведения. Полу­ченные данные изобразить графически, откладывая по оси абс­цисс длину волны измеряемого света, а по оси ординат. — интен­сивность флуоресценции опытных образцов. Сделать вывод о ха­рактере изменений люминесцентных свойств 1,8-АНС в присут­ствии мембранного препарата.

Провести УФ-облучение эритроцитарных мембран согласно методике, описанной в лабораторной работе № 5, в дозах 0,76;

1,51; 3,02; 2,26; 4,53 кДж/м² и зарегистрировать спектры флуо­ресценции зонда в присутствии модифицированных мембран. Построить график зависимости средних значений интенсивнос­ти флуоресценции АНС в его максимуме в присутствии натив­ных и УФ-облученных мембран от дозы УФ-света. Сделать вывод о причинах изменений люминесцентных характеристик A.HLC в комплексе с модифицированными мембранами, индуцированных воздействием УФ-излучения в широком диапазоне длин волн, а также о характере структурных нарушений облученных эритро­цитарных мембран.

II вариант

В качестве зонда использовать DANS-глицин, все операции проводить аналогично описанным в варианте I этой работы.

6.5.