2.1. Характеристика больных

Исследование было выполнено при поддержке гранта Российского Фонда Фундаментальных Исследований № 12-04-00785-а от 2012 г.

ВСЕГО, n=101

ПАЦИЕНТКИ С ПРЕЭКЛАМПСИЕЙ (ПЭ)

средний возраст 34 ± 6,8 лет

n = 83

КОНТРОЛЬ

n = 8

АКУШЕРСКАЯ ГРУППА

(в момент преэклампсии, ПЭ-1)

n = 43

НЕФРОЛОГИЧЕСКАЯ ГРУППА

(1 мес после ПЭ и более, ПЭ-2)

n = 40

КОНТРОЛЬ n = 10

ПЭ ранняя - до 35 нед (ПЭр-1)

n = 28

ПЭ поздняя, после 35 нед (ПЭп-1)

n = 15

ПЭ ранняя (ПЭр-2) n = 30

ПЭ поздняя (ПЭп-2) n = 10

n= 28 сутки 15

n= 13 1 мес 7

n= 9 3 мес 7

n= 5 6 мес 6

n= 4 12 мес 1

n = 13 3 мес 7

n = 11 6 мес 6

n = 9 12 мес 1

n = 7 до 5 лет 3

n = 12 5 и более лет 7

Рисунок 2.1.

В исследование была включена 101 женщина (средний возраст 33±7 лет), наблюдавшаяся в Научном центре акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И.Кулакова (директор – академик РАН Г.Т.Сухих) и в клинике нефрологии, внутренних и профессиональных болезней им. Е.М.Тареева УКБ № 3 Первого

МГМУ им.И.М.Сеченова (директор – академик РАН Н.А.Мухин) в период с 2010 по 2012 гг. Дизайн исследования представлен на рисунке 2.1.

В основную группу вошли 83 пациентки (средний возраст 34 ± 6,8 лет), у которых во время беременности была диагностирована ПЭ, явившаяся единственным критерием включения в исследование. Диагноз ПЭ устанавливали в соответствии с критериями ВОЗ от 2008г., на основании появления после 20 недели гестации артериальной гипертензии (АГ) и протеинурии (ПУ) (более 0,3 г белка в суточной моче) с возможным развитием органной дисфункции.

Женщины, которые были обследованы в момент развития ПЭ, составили

«акушерскую» группу, включившую в себя 43 пациентки, часть из которых были обследованы в динамике на сроках 1, 3, 6, 12 месяцев после родов.

Женщины с ПЭ в анамнезе (рожавшие не менее 3 месяцев назад) и имевшие на момент обследования лабораторные признаки поражения почек и\или артериальную гипертензию, составили «нефрологическую» группу, в которую вошли 40 пациенток (рис.2.1). Ни одна из включенных в исследование женщин до развития ПЭ не имела признаков поражения почек.

В качестве контроля обследованы 18 здоровых женщин: 8 беременных (средний возраст 24,3 ± 3,5 лет) со сроком гестации 36 - 40 нед., а также 10 небеременных рожавших женщин (средний возраст 38 ± 9 лет), имеющих нормальные анализы мочи, уровень креатинина сыворотки и показатели АД.

В зависимости от сроков развития ПЭ пациентки акушерской и нефрологической групп были разделены на 4 подгруппы. В подгруппу ПЭр-1 - акушерскую с ранним началом ПЭ - до 35 недели беременности - вошли 28 женщин (33,7%), в подгруппу ПЭп-1- акушерскую с поздней ПЭ - после 35 недели беременности – 15 (18%), в подгруппу ПЭр-2 - нефрологическую с ранним дебютом ПЭ вошли 30 (36,2%), в подгруппу ПЭп-2 - нефрологическую с поздней ПЭ – 10 (12 %) пациенток (рис.2.1.)

Признаки поражения почек, независимо от того, обследована ли пациентка в момент ПЭ или в разные сроки после её развития, включали в себя: мочевой

синдром, артериальную гипертензию и нарушение функции почек в различных сочетаниях.

Общеклинические методы исследования

Критериями АГ у беременных считались систолическое АД (САД) ≥ 140 мм рт. ст. и/или диастолическое АД (ДАД) ≥ 90 мм рт. ст. [1, 46]. Критериями диагностики АГ у небеременных женщин считались САД > 140 мм рт. ст. и/или ДАД > 90 мм рт. ст. до назначения антигипертензивных препаратов. Тяжелой АГ считали повышение АД до 180 и 110 мм рт. ст.

Протеинурию у беременных определяли как суточную экскрецию белка 0,3 г и более; вне беременности - 0,15 г и более.

Всем женщинам были исследованы общеклинические, биохимические показатели крови, в т.ч. альбумин, аланинаминотрансфераза (АЛТ), аспартатаминотрансфераза (АСТ). Анемию определяли при НВ < 110 г/л у беременных и < 120 г/л вне беременности, тромбоцитопению – при Тr < 150 тыс. Снижение альбумина менее 25 г/л у беременных и 35 г/л у небеременных считали гипоальбуминемией; нарастание трансаминаз регистрировали при АЛТ, АСТ свыше 40 ед/л.

Нарушение функции почек у беременных пациенток констатировали при значении скорости клубочковой фильтрации (СКФ) по методу Реберга-Тареева ниже 100 мл/мин и/или при уровне креатинина сыворотки (СКр) более 90 мкмоль/л; вне беременности – СКФ ниже 80 мл/мин и/или уровне креатинина сыворотки более 130 мкмоль/л. «Почечным исходом» считали стабильное повышение уровня СКр > 120 мкмоль/л или 1,4 мг/дл в течение не менее 6 мес.

У пациенток акушерской группы (ПЭ-1) в момент развития ПЭ и у женщин группы контроля помимо стандартных гемостазиологических параметров (активированного частичного тромбопластинового времени - АЧТВ, фибриногена, протромбинового индекса) перед родами определяли маркеры тромбогенеза (растворимые комплексы фибрин-мономеров (РКФМ) и д- димеры), значения которых оценивали в соответствии со сроками гестации.

Исследовались также маркеры микроангиопатического гемолиза - лактатдегидрогеназа (ЛДГ) и шизоциты в мазке пеиферической крови. Наличие активации внутрисосудистого свертывания констатировали при уровне д- димеров – более 2000 мкг/л, значении РКФМ как «резкоположительном»; повышением ЛДГ считали концентрацию свыше 480 ед/л, шизоцитозом - показатели более 0,05 %.

Данные параметры были исследованы и в нефрологической группе с поправками допустимых значений д-димеров до 250 мкг/л, отсутствием РКФМ.

Указанные клинические и лабораторные показатели в группе ПЭ-1 регистрировали, начиная со второго триместра беременности, при поступлении в НЦАГиП им. В.И.Кулакова с признаками ПЭ либо для планового родоразрешения и через сутки после родов.

Специальные лабораторные методы исследования

У 54 пациенток (у 22 женщин акушерской (ПЭ-1) и 32 – нефрологической (ПЭ-2) групп) были определены лабораторные маркеры тромбофилии (ТФ): антифосфолипидные антитела (АФА) и полиморфизмы генов свертывания крови. Диагноз антифосфолипидного синдрома (АФС) установливали в соответствии с критериями, принятыми в Саппоро в 1998 г. с дополнениями 2004 г., на основании сочетания артериальных, венозных и/или

микроциркуляторных тромбозов и/или акушерской патологии (синдром потери плода, в т.ч. тяжелая ПЭ или эклампсия до 34 нед. беременности, плацентарная недостаточность) с серологическими маркерами (антитела к кардиолипину (АКЛ) класса IgG и/или IgM, и/или антитела к β-2-ГП-I класса IgG и/или IgM, и\или «волчаночный антикоагулянт»). Диагноз наследственной ТФ (НТФ) устанавливали при выявлении одного и/или более полиморфизмов генов, кодирующих синтез факторов системы свертывания крови. Комбинированной ТФ считали одновременное носительство АФА и полиморфизмов генов гемостаза.

Исследованы следующие гены (у 19 женщин гр. ПЭ-1 и 28 женщин гр. ПЭ-2) (табл.2.1.):

- фактора V G1691A (фактор V Leiden G1691A) – n=47,

- протромбина G20210A (PTG G20210A) – n=47,

- ингибитора активатора плазминогена 1-го типа -675 5G/4G (PAI-1 -675 5G/4G) - n=47,

- в-цепи фибриногена -455 G>A (FGB -455 G>A) – n=47,

- метилентетрагидрофолатредуктазы С677Т (MTHFR C677T) – n=47,

- метионин-синтазы-редуктазы MTRR A66G (MTRR A66G) – n=32,

- метионин-синтазы MTR A2756G (MTR A2756G) – n=32.

Частота распределения генотипов в обследованной когорте больных соответствовала равновесию Харди-Вайнберга и достоверно не отличалась от частоты встречаемости в популяции.

Таблица 2.1. Распределение генотипов исследованных генов гемостаза у пациенток основной группы

У всех 54 (100%) обследованных с этой целью женщин, была выявлена та или иная форма тромбофилии: АФС выявлен у 7 (13%), НТФ – у 30 (55,5%) и КТФ – у 17 (31,5%) пациенток.

Мы не проводили статистической оценки различия частоты полиморфизмов генов между женщинами с ПЭ и в популяции в связи с малым количеством больных. Однако среди женщин с ПЭ обращает на себя внимание бoльшая частота выявления мутаций практически во всех исследуемых генах, кодирующих синтез факторов системы свертывания крови, что соответствует

литературным данным о влиянии генетической тромбофилии на развитие гестационных осложнений [51].

Из акушерской группы были обследованы на ТФ 22 из 43 пациенток, что составило 52,2%. У всех них была выявлена тромбофилия: НТФ - у 59,2%,

«чистый» АФС - у 13,6% и КТФ - у 27,2% (Рис.2.2).

Рисунок 2.2. Структура выявленной тромбофилии в акушерской группе

В нефрологической группе на наличие ТФ были обследованы 32 из 40 пациенток (80%). Все они также имели тромбофилию, причем разные её формы были выявлены с частотой, сопоставимой с таковой в акушерской группе: наследственная тромбофилия - у 53,1%, «чистый» АФС – у 12,5%, комбинированная ТФ – у 34,4% (Рис.2.3).

Рисунок 2.3 . Структура выявленной тромбофилии в нефрологической группе

У пациенток акушерской группы в момент развития ПЭ и у женщин группы контроля перед родами определяли содержание в плазме крови васкулоэндотелиального фактора роста (VEGF) и растворимых рецепторов к нему, известных как тирозин-киназоподобные рецепторы (sFlt-1 или VEGFR1), а также подоцина и нефрина в моче методом ELISA.

Метод ELISA основан на принципе "сэндвича": во время первой иммунологической реакции (инкубационная стадия) молекулярные медиаторы, содержащиеся в моче, связываются в комплексы с посаженными на пластиковую основу первичными моноклональными антителами мыши; во время второй иммунологической реакции добавляются меченые биотином вторичные антитела (конъюгат) и связывающийся с биотином ферментный комплекс стептавидин- пероксидаза, в результате образуется "сэндвич" с полученными на предыдущей стадии комплексами антиген-антитело. Конъюгат связывается с комплексом в количестве, пропорциональном содержанию медиатора в моче. Конъюгат, не связанный с комплексом «антиген-антитело», вымывается (происходит разделение свободного и связанного антигенов). Содержание связанного с конъюгатом антигена определяют спектрофотометрически после добавления хромогенного субстрата и серной кислоты для торможения реакции. Концентрацию медиатора в моче определяют по калибровочной кривой, которая строится исследователем с использованием стандартных растворов с известной концентрацией, прилагаемых к набору реактивов.

Концентрация VEGF в плазме выражалась в пикограммах на миллилитр (пг/мл), sFlt-1в плазме и подоцина в моче - в нанограммах на миллилитр (нг/мл).

Исследования медиаторов в крови и моче у женщин с ПЭ методом ELISA проведены на базе кафедры нефрологии клиники им. Е.М. Тареева (зав. отделом нефрологии НИЦ, д.м.н. – И.Н.Бобкова) и иммунологической лаборатории клиники им. Е.М. Тареева (зав. лабораторией иммунологии – А.Г. Серова).

Эти же показатели исследованы в динамике через 1, 3, 6 месяцев после родов у женщин I группы, остававшихся под наблюдением. Уровни VEGF, sFlt-1 в

крови, подоцина и нефрина в моче также были определены пациенткам нефрологической группы и небеременным женщинам контрольной группы (таб.2.2).

Таблица 2.2. Специальные методы исследования

Специальные визуализирующие методы исследования