СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ АСКОРБИНАТОКСИДАЗЫ

В методе спектрофотометрического определения активности аскорби- натоксидазы использовано свойство аскорбиновой кислоты поглощать свет с максимумом при длине волны 265 нм. Об активности фермента су­дят по уменьшению величины оптической плотности, учитывая, что сте­пень окисления аскорбиновой кислоты пропорциональна количеству фер­мента [1].

Реактивы

1. Фосфатный буфер с pH 7,3-7,4.

2. 5* 10'³ М раствор .

3. 5‘10'³ М раствор MgSO₄.

4. 5* 10"⁵ М раствор аскорбиновой кислоты.

Ход анализа

Навеску листьев 1г ±0,001 г тщательно растирают в фарфоровой ступке и переносят в мерную колбу на 50 см³ с помощью охлаждённого фосфат­ного буфера. Экстракт центрифугируют при 4000 об/мин или фильтруют на холоде в течение короткого времени. В опытную кювету вносят 0,1 см³ раствора MgSO₄, 2 см³ фосфатного буфера, 0,1см³ ферментной вытяжки (центрифугата или фильтрата) и 0,7 см³ аскорбиновой кислоты. Устанав­ливают нулевое положение на приборе по кювете, в которую вносят те же компоненты, что и в опыте, только вместо аскорбиновой кислоты прили­вают 0,7 см³ Н₂О. С началом измерения опытного образца включают се­кундомер. Первое измерение проводят через 30 с, а затем повторно каж­дую минуту в течение 5-6 минут или другого интервала времени в зависи­мости от активности фермента.

При длительной экспозиции делают контроль на самоокисление аскор­биновой кислоты. Для этого в кювету спектрофотометра вносят 2,3 см³ фосфатного буфера и 0,7 см³ аскорбиновой кислоты, определяют оптиче­

скую плотность контрольного раствора в те же промежутки времени, что и основного раствора.

Активность фермента А, выраженную в единицах оптической плотно­сти, вычисляют по формуле :

где Dj - оптическая плотность раствора в начале определения;

D2 - оптическая плотность раствора через определённый промежуток времени;

V- общий объём экстракта, см³;

Vг объём фильтрата в кювете, см³;

V2- общий объём жидкости в кювете, см³; t - время, мин; н - масса навески, г.

Литература

1. Ермаков А.И., Арасимович В.В., Ярош Н.Е[., Перуанский Ю.В., Луковнико- ва Г.А., Иконникова М.И. Методы биохимического исследования растений. Л.: Агропромиздат, 1987. С. 44-45.