ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА МЕМБРАННЫХ БЕЛКОВ

Исследование структурно-функционального состояния мемб­ранных белков осуществляют после проведения двух важнейших этапов:

— выделения и очистки определенного белка;

— анализа полученной фракции для определения ее чистоты и исследования структуры чистого компонента.

В разделе 5.2. были охарактеризованы методы выделения мем­бранных структур, которые широко используются и для получе­ния мембранных белков. Поэтому остановимся на некоторых воп­росах, касающихся очистки интегральных мембранных белков с применением детергентов.

Детергенты — это группа амфифильных соединений, кото­рые способны связываться с гидрофобными участками мембран­ных белков, контактирующими с липидной фазой мембран, тем самым разрушая ее структуру. В ходе солюбилизации мембран детергентами последние модифицируют бислой липидов, разрых­ляя его, затем образуют смешанные (белок-липид-детергентные) мицеллы, а в конечном итоге — детергент-белковые и липид- детергентные мицеллы. Для сохранения мембранных белков в растворимом состоянии необходимо постоянное присутствие де­тергента. Его удаление приводит к агрегации и последующему осаждению молекул белка.

Основной проблемой очистки белков является подбор де­тергента и оптимальных условий солюбилизации их молекул. Детергент не должен нарушать высшие типы пространствен­ной организации белков, а лишь замещать молекулы липидов, контактирующие с гидрофобными участками белковой глобу­лы. Критерий максимальной солюбилизации белка — переход его молекул в надосадочную жидкость после осаждения мемб­ран. Причем важным требованием процедуры солюбилизации является сохранение функциональной активности биополиме­ра и его стабилизация. Для этого в исследуемую систему до­бавляют экзогенные фосфолипиды, глицерин, ингибиторы про­теаз. Следует отметить, что получаемые при очистке белок- детергентные комплексы могут содержать значительные ко­личества связанных фосфолипидов, что необходимо учитывать при дальнейшем разделении и характеристике получаемого препарата белка.

При выборе детергента необходимо учитывать:

1) критическую концентрацию мицеллообразования и размер мицелл детергента;

2) заряд детергента;

3) возможность осаждения при определенном значении pH;

4) возможность светопоглощения в диапазоне длин волн, ис­пользуемом при определении концентрации белка оптическим методом (при 280 нм).

Если концентрация детергента превышает критическую концентрацию мицеллообразования, то детергент полностью солюбилизирует мембранные структуры. В противоположном случае (концентрация меньше ККМ) детергент модифицирует мембрану, не разрушая полностью липидный бислой. Кроме того, необходимо учитывать зависимость этого параметра от температуры и ионной силы среды. Детергенты с низкой ККМ, образующие крупные мицеллы, вследствие низкой концент­рации мономеров не способны полностью удаляться при диа­лизе или ультрафильтрации, что может привести к денатура­ции белка при накоплении молекул детергента. Поэтому удоб­нее пользоваться детергентами с высокими значениями ККМ (цвиттерионные детергенты, соли желчных кислот, октилглю- козид). Еще одной характеристикой детергента является его агрегационное число. Это количество молекул, входящих в состав одной мицеллы. Детергенты с высоким агрегационным числом образуют выраженные мицеллярные структуры, ко­торые внедряются в липидный бислой и солюбилизируют его. Детергенты с низким агрегационным числом не способны образовывать собственные мицеллы и лишь встраиваются в бислой липидов.

Выбор детергента для выделения и очистки определенного мембранного белка осуществляется методом проб и ошибок, од­нако исследователи стремятся к использованию минимальных концентраций детергента с целью сохранения нативного струк­турно-функционального состояния изучаемого белка. Наиболее эффективными считают неионные детергенты (тритон Х-100, ок- тилглюкозид), соли желчных кислот (холат, дезоксихолат), цвит­терионные детергенты.

На рис. 60 приведены структурные формулы, а в табл. 18 описаны свойства некоторых детергентов, используемых для вы­деления и очистки мембранных белков.

Рис. 60. Структурные формулы некоторых детергентов, используе мых в мембранологии

Таблица 18

Свойства некоторых детергентов

* Полидисперсная смесь, приведены средние значения.

5.5.