СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВОССТАНОВЛЕННОГО И ОКИСЛЕННОГО РИБОФЛАВИНА

(по Г.Н. Чупахиной, А.С. Гребенникову, Н.С. Лейба)

Рибофлавин (водорастворимый витамин В₂) входит в состав кофермен- тов-флавинаденинмононуклеотида (ФМН) и флавинадениндинуклеотида (ФАД) дыхательных ферментов.

В основу данного метода количественного определения суммарного рибофлавина и его окисленной и восстановленной форм в растительных

тканях положен спектрофотометрический метод анализа рибофлавина в культуральной жидкости штаммов-продуцентов [1], а также флуореметри- ческий метод определения рибофлавина в растениях [2].

Для определения содержания рибофлавина навеску анализируемого растительного материала (1г) растирают в фарфоровой ступке с добавле­нием 15 мл 0,1 н. раствора НС1 до гомогенного состояния.

Растёртую массу количественно переносят в мерный цилиндр на 100 мл и доводят объём смеси 0,1н раствором НС1 до 75 мл. Затем содержимое мерного цилиндра переносят в термоустойчивую колбу на 100 мл, которую выдерживают на водяной бане в течение 45 минут при частом помешива­нии.

Термическая обработка в кислой среде разрушает пигменты и способ­ствует освобождению рибофлавина. По окончании экспозиции содержимое колбы охлаждают и отфильтровывают с помощью бумажного или стек­лянного фильтра № 4.

Оптическую плотность раствора определяют спектрофотометрически при 445 нм по отношению к растворителю (01н раствор НС1). Содержание рибофлавина рассчитывают по калибровочному графику. Таким образом определяется окисленная форма рибофлавина.

Для определения общего содержания рибофлавина проводят окисление его восстановленной формы. Для этого в пробирку с притертой пробкой приливают 5 мл фильтрата и нейтрализуют его 0,1 н. раствором NaOH (рН=7).

Рассчитывают суммарное содержание восстановленного и окисленного рибофлавина по калибровочному графику. По разнице определяют вос­становленный рибофлавин.

Для построения калибровочного графика навеску чистого рибофлавина (20 мг) растворяют в 500 мл дистиллированной воды. Из данного раствора путём разбавления готовят серию стандартных растворов, содержащих от 1,2 мкг до 12 мкг рибофлавина в 1 мл. Оптическую плотность полученных растворов определяют при 445нм и по результатам спектофотометрирова- ния строят калибровочный график. Количественное содержаеие рибофла­вина выражают в мкг/г растительной ткани.

Литература

1. Полануер Б.М., Дедова О.А., Гаспаров В.С. Сравнение различных методов количественного определения рибофлавина в культуральной жидкости штам­мов-продуцентов // Биотехнология. 1995. №5-6. С. 44-47.

2. Ермаков А.И., Арасимович В.В., Смирнова-Иконникова М.М., Ярош Н.П., Луковникова Г.А. Методы биохимического исследования растений. Л.: Колос, 1972. С. 104-106.