Структура и состав нативных и окисленных ЛНП

После приема пищи в кишечнике образуются хиломикроны, которые из кровотока быстро поглощаются печенью: через 12 ч после еды хиломикроны в крови не обнаруживаются. В печени синтезируются богатые триглицеридами липопротеины очень низкой плотности, основной функцией которых является снабжение периферических тканей жирными кислотами.

При изучении свободнорадикального окисления особое внимание уделяется ЛНП, ибо эти частицы в физиологических условиях могут окислительно модифицироваться и становиться цитотоксичными в отличие от липопротеинов высокой плотности, которые такой способностью не обладают [751].

Нативные ЛНП человека представляют собой сферические частицы объемом около 4 · 10^-18 см³, диаметром 19—27 нм и молекулярной массой от 1800 до 2800 кДа (рис. 8). Гидратированная плотность ЛНП (1,019—1,063 г/мл) позволяет выделять их из сыворотки с помощью ультрацентрифугирования, при этом в дальнейшем они могут быть разделены на несколько субфракций, разных по размеру, молекулярному весу и плотности [932]. Выделяются два генетически обусловленных фенотипа: около 3/4 всех людей относятся к фенотипу А, ЛНП которых имеют диаметр 26—27 нм и низкую плотность (1,025—1,038 г/мл) и подразделяются на три субкласса: ЛНП 1, ЛНП 2, ЛНП

3. У людей с фенотипом В (около 1/4 всей популяции) ЛНП имеют меньший диаметр (< 25 нм) и большую плотность (> 1,038 г/мл), у них выделяется два субкласса: ЛНП 4 и ЛНП 5 [280, 585]. Характер фенотипа наследуется, однако внешние факторы оказывают влияние на распределение частиц ЛНП по субклассам [1649]. Более плотные субфракции содержат больше холестерина, в них также повышено соотношение холестерин/ белок [156]. В исследованиях in vitro показана обратная зависимость между плотностью частиц ЛНП и эффективностью их окисления: меньшие по размеру и более плотные частицы окисляются быстрее, чем большие и менее плотные [430, 585, 1649] (величина лаг-фазы, характеризующей эффективность Cu- или Fе-индуцированного окисления, уменьшается на 60 % при переходе от субфракции ЛНП1 к ЛНП5 [585]). У больных ишемической болезнью сердца резистентность ЛНП к Cu-индуцированному окислению снижена, данное снижение наблюдается во всех субфракциях [156]. Эпидемиологические исследования выявили, что у людей с наследственным фенотипом В высокая плотность ЛНП ассоциируется с повышенным риском инфаркта миокарда и патологией коронарных сосудов [430, 589]; у женщин размеры частиц ЛНП больше и их атеро- генность ниже, чем у мужчин [1212].

Химический состав ЛНП представлен в табл. 5. Если принять молекулярную массу ЛНП за 2500 кДа, то на каждую частицу приходится около 1600 молекул эфиров холестерина и 200 молекул триглицеридов, которые организуют центральное липофильное ядро, окруженное монослоем из 700 молекул фосфолипидов и 600 молекул свободного холестерина; в монослой встроен апопротеин В (апо В) — белок с молекулярной массой около 500 кДа, служащий для рецепторного связывания ЛНП с клетками (см. рис. 8) [584]. Имеются данные, что на поверхности частиц ЛНП апо В располагается тонким слоем (толщиной около 1 нм) и покрывает площадь около 480 нм² [171]. Основным субстратом свободнорадикального окисления в ЛНП служат ненасыщенные жирные кислоты, среди которых главной (около 90 % общего состава) является линолевая, содержащая 18 атомов углерода и 2 двойные связи: 18 : 2 (ω-6). Добавление в корм кроликам избыточного количества линолевой кислоты увеличивает ее содержание в частицах ЛНП и повышает окисляемость ЛНП; замена в питании линолевой кислоты на олеиновую, 18 : 1 (ω-6), содержащую только одну двойную связь, снижает способность ЛНП к окислению [1289]. Положительный эффект, усиливающий резистентность ЛНП к окислению, диеты

Таблица 5

Липидный, жирнокислотный и антиоксидантный состав нативных и окисленных ЛНП

[584, 589]

Примечание: і — уменьшение, t — увеличение.

с повышенным содержанием олеиновой или насыщенных жирных кислот показан также у человека [352, 1391].

Выделенные из атеросклеротических бляшек ЛНП по сравнению с нативными имеют повышенное содержание перекисей липидов, сниженное содержание ненасыщенных жирных кислот, фрагментированный апо В, отрицательный заряд и высокое сродство к скэвинджер-рецепторам макрофагов [1818]. Аналогичные изменения в ЛНП наблюдаются при их длительном (несколько месяцев) хранении, при инкубации с ионами железа или меди [171, 584]. Вместе с тем не выявлено различия в содержании жирорастворимых антиоксидантов (α-токоферол, β-каротин) в липопротеинах атеросклеротических бляшек и сыворотки крови, в то время как окисление in vitro приводит к снижению содержания данных антиоксидантов в ЛНП [1612].

Свободнорадикальное окисление ЛНП, индуцированное ионами металлов переменной валентности (Cu+ или Fе²+), приводит к изменению их химического состава, что характеризуется снижением содержания свободных жирных кислот, полным исчезновением антиоксидантов и значительным повышением содержания продуктов окисления (гидроперекисей, оксистеролов, диенов), которых в свежевыделенных ЛНП мало (см. табл. 5). Окисление ЛНП приводит также к изменению их физических и биологических свойств (табл. 6). Увеличение отрицательного заряда в окисленных ЛНП является результатом накопления отрицательно заряженных продуктов ПОЛ и окисления положительно заряженных лизиновых остатков апо В (двадцатичасовая инкубация ЛНП с 5 мкМ CuSO₄ приводит к модификации 32 % лизиновых остатков апо В, при этом поверхностный потенциал частиц изменяется от —16 мВ до —42 мВ [171]). Изменение заряда при окислении ЛНП приводит к изменению электрофоретической подвижности частиц в агарозном геле [1508] и повышению аффинности окисленных ЛНП к скэвинджер-рецепторам, что определяет высокую эффективность их захвата и деградации макрофагами, в то же время сродство к рецепторам для нативных ЛНП снижается, в результате снижается их захват фибробластами.

Таблица 6

Изменение физических характеристик и биологической активности окисленных и выделенных из атеросклеротических бляшек ЛНП по сравнению с нативными ЛНП сыворотки здоровых людей [1816]

фосфолипидами (фосфатидилсерин, фосфатидилглицерол, кардиолипин) усиливает их захват макрофагами, что приводит к накоплению в клетках эфиров холестерина [684]. Усиление собственной флюоресценции окисленных ЛНП (возбуждение при 365 нм, эмиссия при 430 нм) определяется появлением структур с шиффовыми основаниями. Образование таких структур определяет конформационные изменения частиц ЛНП, выявляемые с помощью жидкостной хроматографии, и коррелирует с захватом окисленных ЛНП макрофагами [1073].

Окисление ЛНП, индуцированное ионами металлов переменной валентности [456, 925], облучением УФ-светом, липоксигеназами или инкубацией с клетками [417], делает их токсичными в отношении культур фибробластов [925], эндотелиоцитов [1194, 1618], макрофагов [1396] и гладкомышечных клеток [1194]. В основе цитотоксичности может лежать накопление продуктов ПОЛ, многие из которых, особенно альдегиды [587] или перекиси, чрезвычайно токсичны не только в отношении культур клеток, но и целого организма [589]. Так, при внутривенном введении смертельная доза LD₅₀ 4-гидроксиноненаля составляет 68 мг/кг веса тела мыши [583]. Хотя средняя концентрация 4-гидроксиноненаля в сыворотке крови человека невелика — в пределах от 0 до 0,7 мкмоль/л (0,28 ± 0,34 мкмоль/л [583]), при окислении это соединение может накапливаться в клетках и частицах ЛНП. Сравнительный анализ токсичности различных продуктов ПОЛ в отношении клеточных культур эндотелиоцитов и фибробластов выявил следующую зависимость по мере убывания эффекта: 2,4-декадиеналь (токсичен при 10 мкМ/л) > гидроперекись линолевой кислоты > 2,4-нонадиеналь > 4-гидроксиноненаль > 2-алкенали >> алканали [583].

Несмотря на высокую токсичность вторичных продуктов свободнорадикального окисления жирных кислот (гидроксиалкеналей и алкеналей), многие исследователи связывают токсическое действие окисленных ЛНП с гидроперекисями. Это вызвано тем, что в отличие от альдегидов гидроперекиси практически не выходят в водную фазу при окислении ЛНП, а проведенные in vitro исследования показывают, что токсичными становятся липопротеиновые частицы, а не среда [1194]. Кроме того, динамика изменения цитотоксичности по мере окисления ЛНП совпадает с образованием гидроперекисей, но отличается от динамики накопления 4-гидроксиноненаля и малонового диальдегида [956]. Изучение действия окисленных ЛНП на эндотелиоциты показало, что цитотоксический эффект зависит от содержания в клетках глутатиона. Бутионин- сульфоксимин — ингибитор γ-глутамилцистеинсинтетазы, ключевого фермента синтеза глутатиона, — усиливал цитотоксическое действие, в то время как L-2-оксотиа- золидин-4-карбоксилат, эффективный источник внутриклеточного цистеина, снижал токсический эффект окисленных ЛНП [958]. Для цитотоксического действия ЛНП на клетки необходимо наличие в среде ионов металлов переменной валентности (Fe или Cu). Присутствие в культуральной среде дефероксамина, хелатора ионов железа, снижало эффект окисленных ЛНП, добавление же FeCl₃ усиливало цитотоксическое действие. Антиоксиданты (пробукол, α-токоферол) снижали повреждение эндотелиоцитов окисленными ЛНП [957]. Суммируя результаты исследований [1194], авторы предположили, что основной цитотоксический эффект окисленных ЛНП ассоцииру-

Рис. 9. Механизмы цитотоксического действия окисленных ЛНП

ется с липидными гидроперекисями, которые мигрируют в мембраны клеток, разлагаются в реакциях с ионами металлов переменной валентности и усиливают процессы ПОЛ, что является причиной гибели клеток (рис. 9).

При окислении ЛНП образуются оксистеролы: 7-кетохолестерин, 7-α- и 7^-гид- роксихолестерин, 5,6-эпоксихолестерин, 25-гидроксихолестерин и другие. Спектр образующихся оксистеролов зависит от способа окисления ЛНП: так, при ^^-индуцированном окислении преимущественно образуется 7-кетохолестерин и 7-а-гид- роксихолестерин; главным продуктом при окислении в присутствии эндотелиоци- тов является 5,6-эпоксихолестерин [328]. Так же как и продукты ПОЛ, окисленные производные холестерина токсичны для клеток. Анализ разных компонентов Cu²+- окисленных ЛНП показал, что суммарная цитотоксичность в отношении человеческих фибробластов на 90 % определяется образованием 7^-гидропероксихолестери- на [456]. Это соединение обнаруживается в свежевыделенных атеросклеротических бляшках, полученных из аорты человека, что подтверждает положение о цитотоксичности окисленных ЛНП in vivo. Одним из механизмов действия оксистеролов на эн- дотелиоциты является повреждение актиновых белков в микротрубочках цитоскелета [1265], что может вызывать апоптотическую гибель клеток. Окисленные производные холестерина широко распространены в пищевых продуктах животного происхождения, особенно подвергшихся термической обработке. Исследования показали, что содержание животных на рационе с повышенным содержанием оксистеролов вызывает характерные предатеросклеротические изменения эндотелия [115]. Это указывает на то, что в этиологии атеросклероза важную роль могут играть соединения экзогенного происхождения.

В повреждении эндотелия сосудов при атеросклерозе важная роль отводится фагоцитирующим клеткам [1349, 1429]. В результате взаимодействия окисленных ЛНП с фагоцитирующими клетками:

• усиливается [277] или угнетается [354] хемотаксис;

• снижается продукция О₂ циркулирующими гранулоцитами человека [354], но усиливается генерация О₂ нейтрофилами из брюшной полости морской свинки [1072] и макрофагами линий U937 и THP-1 [1207];

• ингибируется спонтанная хемилюминесценция макрофагов [73], а также пролиферация моноцитов [861];

• подавляется синтез рецепторов для нативных ЛНП и усиливается синтез факторов роста и цитокинов [772], в частности интерлейкина-1 [1037];

• снижается мембранный потенциал в митохондриях перитонеальных макрофагов мыши [1042];

• повышается содержания холестерина в клеточных мембранах [171].

Сыворотка крови людей с гиперлипидемией ингибировала продукцию О₂, но не

влияла на образование NO₂ в перитонеальных макрофагах крысы в ответ на ФМА [480]. Хемилюминесценция гранулоцитов, выделенных из крови больных атеросклерозом, при стимуляции латексом была повышена, но снижалась до нормальных значений в присутствии сыворотки [409, 539]. На экспериментальной гиперхолестериновой модели атеросклероза у кроликов показано усиление метаболической активности альвеолярных макрофагов [246, 1034], в то же время не обнаружено изменений наработки O₂ макрофагами, выделенными из каррагинановой гранулемы [880]; у циркулирующих в крови гранулоцитов наблюдалось снижение интенсивности дыхательного «взрыва» при стимуляции клеток зимозаном или латексом [409].

Окисленные ЛНП ингибируют наработку NO-радикалов эндотелием [805, 1091], что усиливает адгезию нейтрофилов и повреждение стенки сосудов [1002]. Данный эффект, по-видимому, связан с индукцией генерации супероксидного анион-радикала и ингибированием СОД [1001]. Как показано на культуре эндотелиоцитов и образцах аорты кролика, окисленные ЛНП, а также окисленный апопротеин А стимулируют продукцию O₂ в среднем в 3—3,5 раза, при этом индуцируется апоптоз клеток [639]. Эксперименты с окисленными ЛНП позволяют объяснить нарушение тонуса сосудов и их повреждение, наблюдающиеся при атеросклерозе, однако многочисленные попытки найти точные количественные свидетельства наличия окисленных ЛНП в крови не дают положительных результатов.

В последние годы получила развитие концепция о существовании так называемых «минимально окисленных», «средне окисленных» или «минимально модифицированных» ЛНП. К этому классу относят частицы ЛНП, в которых повышено содержание продуктов ПОЛ (диеновых конъюгатов и продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой, в них в 2—2,5 раза больше, чем в нативных ЛНП, но в 5—10 раз меньше, чем в окисленных ЛНП [93, 1734]), снижен уровень антиоксидантов, электрофоретическая подвижность не изменена, сродство к В/Е-рецепторам сохраняется, а захват через скэвинджер-рецепторы не выявляется [440, 983, 984]. Такие «минимально окисленные» ЛНП медленно удаляются из кровотока, так как у них снижено (но не отменено) связывание с В/Е-рецепторами, в то же время, проникая посредством эндоцитоза в интиму артерий, они подвергаются быстрому окислению с образованием частиц, способных захватываться макрофагами через скэвинджер-рецепторы. Считается, что появление «минимально окисленных» ЛНП является начальной стадией атерогенеза [93, 984]. Поглощение эндотелиоцитами и гладкомышечными клетками таких липопротеинов усиливает связывание моноцитов с эндотелием [324] и индуцирует синтез моноцитарного хемотаксического фактора [508], что приводит к усиленной миграции моноцитов в мышечный слой сосуда. In vitro такие «минимально окисленные» ЛНП вызывают агрегацию тромбоцитов, возможно посредством активации фосфолипазы A₂ [1734].

Изменение химического состава, физических и биологических свойств окисленных ЛНП служит основой методов их выявления и изучения механизмов окислительной модификации [1361]. Наиболее часто в частицах ЛНП определяется содержание ТБК- РП [965], диеновых конъюгатов (изменение поглощения при 234 нм [588]), изменение электрофоретической подвижности [965], собственной флюоресценции [584], скорости захвата ¹²⁵І-меченых ЛНП макрофагами, а также токсичности в отношении клеточных культур [417]. Окисление белковой компоненты ЛНП приводит к появлению у них аутоантигенных свойств, в результате чего в организме синтезируются специфические антитела, образующие с модифицированными ЛНП иммунные комплексы. У больных иногда удается выявить такие комплексы [93]. Антитела можно получить после введения экспериментальным животным химически модифицированных ЛНП и с их помощью — анализировать наличие измененных ЛНП в гомогенатах тканей [772] или крови [1447].