ФОТОКОЛОРИМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТРИОЗ В РАСТИТЕЛЬНОМ МАТЕРИАЛЕ (по Г.Н. Чупахиной,М.В. Куркиной)

Эндогенный пул триоз растений формируется за счет диоксиацетон- фосфата и фосфоглицеринового альдегида фотосинтетического, дыхатель­ного метаболизма и глюконеогенеза, что определяет участие данных моно­сахаридов в важнейших энергетических процессах.

Ход определения

Навеску анализируемого материала (0,5-1,0 г листьев) измельчают ножницами и тщательно растирают в ступке до гомогенного состояния с небольшим количеством (1-2 мл) дистиллированной воды. Полученный гомогенат количественно переносят дистиллированной водой (15 мл) в ко­ническую колбу на 50 мл. Колбу с содержимым хорошо взбалтывают и помещают на кипящую водяную баню, выдерживают в течение 30 минут, периодически помешивая. Затем колбу снимают с водяной бани, охлажда­ют до комнатной температуры и содержимое ее количественно переносят в мерную колбу на 25 мл, объем доводят до метки дистиллированной во­дой. Экстракт хорошо перемешивают и отфильтровывают.

К 0,5 мл фильтрата прибавляют 1 мл смеси 0,2%-ного раствора ТТХ и 2 и. раствора NaOH в соотношении 1:1, смешанных перед применением. Од­новременно готовят контрольный раствор, для которого вместо фильтрата берут 0,5 мл дистиллированной воды.

Количество триоз в 1 мл исследуемого раствора определяют, используя калибровочную кривую для диоксиацетона или формулу. Рассчитывают количество триоз на 1 грамм растительного материала.

Построение калибровочной кривой

Для построения калибровочной кривой 0,1 г диоксиацетона, предвари­тельно высушенного в эксикаторе, в котором в качестве водопоглотителя используется концентрированная серная кислота (95-96%-ная), растворяют в 200 мл дистиллированной воды. Получается раствор, 1 мл которого со­держит 500 мкг диоксиацетона. Из данного раствора делают серию разве­дений, содержащих 5, 10, 15, 20, 25, 30 мкг диоксиацетона в 1 мл.

Из каждого разведения берут по 0,5 мл раствора, прибавляют к нему по 1 мл смеси 2 и. раствора NaOH и 0,2%-ного раствора ТТХ в соотношении 1:1, смешанных перед применением, и ставят на 15 минут в темноту до по­явления розового окрашивания. Затем для растворения осадка добавляют 0,5 мл 3 и. раствора соляной кислоты и 3 мл ацетона. Одновременно гото­вят контрольный раствор, содержащий в качестве пробы 0,5 мл дистилли­рованной воды. Определяют оптическую плотность растворов на КФК-2 при длине волны 490 нм по сравнению с контролем.

Определение проводят в 2-4 повторностях. Данные обрабатывают ме­тодом наименьших квадратов и по полученным результатам строят калиб­ровочную кривую.

Вычисление результатов

Содержание триоз в 1 мл растительной вытяжки определяют по калиб­ровочной кривой или по формуле, характеризующей данную концентраци­онную зависимость. В ходе построения калибровочной кривой нами была получена следующая формула для расчета триоз в 1мл исследуемого рас­твора:

где С - содержание триоз в 1 мл исследуемого раствора в мкг,

у - значение оптической плотности исследуемого раствора.

Содержание триоз на 1 г исследуемого материала вычисляют по фор­муле:

где С - содержание триоз в 1 мл исследуемого раствора, мкг;

V - объем вытяжки, полученный из данной навески; g - навеска исследуемого материала в граммах.

Пример вычисления

Для анализа была взята навеска 0,5 г листьев ячменя. Объем вытяжки, полученный из данной навески, составил 25 мл. Измеренная на КФК-2 оп­тическая плотность исследуемого раствора - 0,024. Используя формулу (1) находим количество триоз в 1 мл исследуемого раствора:

Литература

1. Карклиня В.А., Веверис А.Я., Жигуре Д.Р. Определение диоксиацетона в культуральных жидкостях Acetobacter suboxydans // Прикладная биохимия и микробиология. 1982. Т. 18. Вып. 2. С. 262-265.

2. Плакунова В.Г. Методики количественного определения триоз и глицери­на в культурах микроорганизмов // Микробиология. 1962. Т. 31. Вып.6. С. 1094- 1097.

3. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика. М.: Мир, 1991. С. 302.