МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ПЕРОКСИДАЗЫ

Пероксидаза играет большую роль в процессе дыхания растений. Наи­более распространенными субстратами, на которые действует пероксидаза в тканях растений, являются полифенолы в свободном состоянии или в форме разнообразных соединений (гликозиды, дубильные вещества) и ароматические амины.

Спектрофотометрический метод определения активности пероксида- зы

Метод основан на измерении оптической плотности продуктов реак­ции, образовавшихся при окислении гваякола за определённый промежу­ток времени [1].

Реактивы

1. 0,15 М фосфатный буфер с pH 5,4.

2. 0,15%-й раствор перекиси водорода.

3. Раствор гваякола (183 мг на 25 см³ воды), готовится в день употреб­ления.

Ход анализа

Навеску растительного материала 200-500 мт растирают в фарфоровой ступке с небольшим количеством фосфатного буфера и переносят в мер­ную колбу на 25 см³, доводят буфером до метки и через 10 минут настаи­вания экстракт центрифугируют при 4000-6000 об/мин в течение 10 ми­нут.

В опытную кювету спектрофотометра с рабочей длиной 1 см вносят 0,5 см³ субстрата, 1,5 см³ буферного раствора, 0,5 см³ ферментной вытяжки (центрифугата) и 0,5 см³ раствора перекиси водорода. С внесением первой капли перекиси водорода включают секундомер. Первое измерение прово­дят через 20 с. Отсчеты снимают несколько раз через 20 с в течение 1 -2 мин или другого интервала времени. Предварительно устанавливают в нулевом положении стрелку амперметра прибора по контрольной кювете, в кото­рую вносят компоненты реакционной смеси, но вместо перекиси водорода - такое же количество воды (0,5 см³). Оптическую плотность растворов измеряют при 470 нм (максимум поглощения тетрагваякола). Активность А выражают в относительных единицах на 1 г сырой массы (или на единицу белка) по формуле:

где Di - оптическая плотность раствора в начале опыта (первое измерение); D₂ - оптическая плотность раствора в конце опыта; ti и t₂ - время начала и конца опыта, с; и- масса навески, г; V- общий

исходный объём вытяжки, см³;

Vi - объём, взятый для проведения реакции, см³;

V₂ - общий объём жидкости в кювете, см³;

60 - коэффициент перевода в минуты.