Методы определения жизнеспособности яиц и личинок гельминтов

При обнаружении яиц гельминтов на различных объектах окружающей среды (почва, вода, овощи и др.) всегда необходимо определять их жизнеспособность по внешнему виду, окрашиванием витальными красками, культивированием в оптимальных условиях и постановкой биологической пробы, т.е.

Определение жизнеспособности яиц или личинок гельминтов по внешнему виду. Яйца гельминтов микроскопируют вначале при малом, затем при большом увеличении. У деформированных и мертвых яиц гельминтов оболочка разорвана или прогнута внутрь, плазма мутная, разрыхлена. У сегментированных яиц шары дробления (бластомеры) неравного размера, неправильной формы, часто сдвинуты к одному полюсу. Иногда встречаются аномальные яйца, которые, имея внешние уродства, развиваются нормально. У живых личинок аскарид мелкая зернистость имеется только в средней час- ти тела, по мере их гибели зернистость распространяется по всему телу, появляются крупные блестящие гиалиновые вакуоли так называемые нитки жемчуга.

Для определения жизнеспособности зрелых яиц аскарид, власоглавов, остриц следует вызывать активные движения личинок легким подогреванием препарата (до температуры не выше 37 0C). Жизнеспособность личинок аскарид и власоглавов удобнее наблюдать после их выделения из скорлупы яйца надавливанием на покровное стекло препарата препаровальной иглой или пинцетом.

У инвазионных личинок аскарид часто замечается чехлик, отсло- ившийся на головном конце, а у закончивших развитие в яйце личинок власоглавов на этом месте при большом увеличении обнаруживается стилет. У погибших личинок гельминтов независимо от места их нахождения (в яйце или вне его) замечают распад тела. При этом внутренняя структура личинки становится глыбчатой или зернистой, атело мутным и непрозрачным. B теле обнаруживаются вакуоли, а на кутикуле — разрывы.

Жизнеспособность онкосфер тениид (бычьего, свиного цепней и др.) определяют по движению зародышей при воздействии на них пищеварительных ферментов.

Если поместить яйца тениид в 1 % раствор натрия сульфида, или 20 % раствор натрия гипохлорида, или же в 1 % раствор хлорной воды при 36—38 0C, зрелые и живые зародыши освобождаются от оболочек и не изменяются в течение 1 сут. Незрелые и мертвые онкосферы сморщиваются или набухают и резко увеличиваются, а затем «растворяются» в течение 10 мин — 2 ч. Живые зародыши тениид также активно двигаются в смеси 1 % раствора натрия хлорида, 0,5 % раствора натрия гидрокарбоната и желчи при 36— 38 0C.

Жизнеспособность сколексов эхинококков определяют при слабом нагревании. Для этого отмытые в воде сколексы или выводковые капсулы помещают в каплю воды на предметное стекло с луночкой, покрывают покровным стеклом и исследуют под микроскопом с нагревательным столиком при температуре 38 39 °С. Если отсутствует нагревательный столик, препарат подогревают при помощи любого источника тепла. При этом жизнеспособные сколексы активно двигаются, сокращая или расслабляя присоски, удлиняя и укорачивая хоботок. Если поместить сколексы в 0,5—1 % водный раствор филицилена при комнатной температуре, то все

жизнеспособные сколексы быстро вывернутся и погибнут. Нежизнеспособные сколексы при этом не вывертываются.

Жизнеспособность адолескариев фасциол, собранных на растениях и других объектах водоемов, проверяют исследованием их на предметном стекле в физиологическом растворе под микроскопом с нагревательным столиком. При подогревании личинки трематоды, находящиеся в цисте, начинают двигаться.

Жизнеспособность яиц карликового цепня определяют по расположению крючьев на зародыше.

B живых яйцах карликового цепня происходят вялые маятникообразные движения протоплазмы и почти незаметные раздвигания и сдвигания заостренных концов латеральной пары крючьев в стороны от средней пары.

Сокращения протоплазмы зародыша и зародышевых крючьев помогают зародышу освободиться сначала от оболочек онкосферы, а затем и от наружной оболочки яйца.

B живом яйце медианная пара и боковые пары крючьев расположены параллельно, в некоторых яйцах лезвия боковых пар сближены и расположены по отношению к средней паре крючьев под углом менее 45°.

Погибающий зародыш конвульсивно сокращается и вяло раздвигает крючья. B погибшем зародыше движение крючьев прекращается, и они располагаются в беспорядке, иногда же латеральные по отношению к соседней паре крючья бывают раздвинуты под прямым, тупым или острым углом.

Иногда наблюдаются сморщивание зародыща, образование зернистости. Более точен метод, основанный на появлении движений онкосферы при резкой смене температур: от 5—10 до 38—40 0C.

Определение жизнеспособности незрелых нематод следует изучать во влажной камере (чашках Петри), помещая яйца аскарид в 3 % раствор формалина, приготовленный на изотоническом растворе натрия хлорида при температуре 24—30 0C, яйца власоглавов в 3 % раствор соляной кислоты при температуре 30—35 0C, яйца остриц в изотонический раствор натрия хлорида при температуре 37 0C. Чашки Петри следует открывать 1—3 раза в неделю для лучшей аэрации и снова увлажнять фильтровальную бумагу чистой водой.

Наблюдения за развитием яиц гельминтов ведут не реже 2 раз в неделю. Отсутствие признаков развития в течение 2—3 мес свидетельствует о их нежизнеспособности. Признаками развития яиц гельминтов являются сначала стадии дробления, деление содержимого яйца на отдельные бластомеры. B течение первых суток развивается до 16 бластомер, которые переходят во вторую стадию — мору- лу и т.д.

Яйца анкилостомид культивируют в стеклянном цилиндре (высотой 50 см и диаметром 7 см), закрытом пробкой. Смесь из равных объемов стерильного песка, древесного угля и испражнений с яйцами анкилостомид, разведенную водой до полужидкой консистенции, осторожно наливают на дно цилиндра при помощи стеклянной трубки.

Личинки анкилостомид и стронгилоид культивируют на агаре в чашке Петри с животным углем. После нахождения в термостате при температуре 26—30 0C в течение 5—6 сут личинки расползаются по агару, оставляя за собой дорожку из бактерий (метод Фюлле- борна).

Метод Harada и Mori (1955). B пробирки, помещенные в штатив, добавляют 7 мл дистиллированной воды. Деревянной палочкой берут 0,5 г испражнений и делают мазок на фильтровальноД бумаге (15X150 мм) в 5 см от левого края (эту операцию проводят на листе бумаги, чтобы защитить поверхность лабораторного стола). Затем полоску с мазком вставляют в пробирку так, чтобы свободный от мазка левый конец достигал дна пробирки. Верхний конец накрывают куском целлофана и плотно обхватывают резинкой. Ha пробирке пишут номер и фамилию обследуемого. B таком состоянии пробирки хранят в течение 8—10 сут при температуре 28 0C. Для изучения культуры снимают и удаляют целлофановую покрышку и извлекают пинцетом полоску фильтровальной бумаги. При этом следует проявлять осторожность, так как небольшое количество инвазионных личинок может передвигаться к верхнему концу фильтровальной бумаги или к стенке пробирки и проникать под поверхность целлофана.

Пробирки помещают в горячую водяную баню при температуре 50 0C на 15 мин, после чего содержимое их встряхивают и быстро переливают в 15-миллилитровую пробирку для осаждения личинок. После центрифугирования надосадочную жидкость удаляют, а осадок переносят на предметное стекло, накрывают покровным стеклом и микроскопируют под малым увеличением.

Для дифференциального диагноза филяриевидных личинок необходимо пользоваться данными, представленными в табл.13.

Методы окрашивания яиц и личинок гельминтов. Мертвые ткани в большинстве случаев воспринимают краски быстрее, чем живые. Эти особенности используют в гельминтологии для определения жизнеспособности яиц и личинок гельминтов. Однако в отдельных случаях некоторые краски лучше воспринимаются живыми тканями, чем мертвыми.

T а б л и ц a 13. Дифференциальная диагностика филярневидных личинок A.duodenale, N.americanus, Strongyloides stercoralis, Trichostrongylus spp.

Для дифференциального распознавания живых и мертвых яиц и личинок применяют следующие краски и способы.

Для окраски живых и мертвых тканей используют лейкобазу метиленового синего. Живая клетка или ткань редуцируют метиленовый синий в бесцветную лейкобазу, мертвая ткань не обладает такой способностью, поэтому приобретает окраску.

Для окраски яиц аскарид можно использовать метиленовый синий в растворе молочной кислоты с едкой щелочью (метиленового синего 0,05 г, едкого натра 0,5 г, молочной кислоты 15 мл). Живые яйца окраску не воспринимают, зародыши мертвых яиц окрашиваются в синий цвет.

Метод окрашивания неприменим для незрелых яиц аскарид и власоглавов; пигментированная оболочка прокрашивается, и поэтому не видно, окрасилась ли зародышевая клетка внутри яйца.

Окрашивание личинок аскарид основным раствором краски бриллианткрезилового синего в концентрации 1:10 000 осуществляют следующим образом: на предметное стекло наносят каплю жидкости с яйцами аскарид и каплю основного раствора краски. Препарат накрывают покровным стеклом, которое плотно прижимают к предметному при легком постукивании препаровальной иглой. Под микроскопом наблюдают количество вышедших личинок и степень их окрашиваемости, после чего этот же препарат просматривают повторно через 2—3 ч. Живыми считаются только недефор- мированные личинки, не окрасившиеся в течение 2 ч. Мертвые личинки окрашиваются при разрыве скорлупы (частично или полностью).

Указывается на возможность окраски препаратов раствором йода при определении жизнеспособности яиц аскаридий птиц. B качестве красителя в этом случае используют 5 % спиртовой раствор йода. При его нанесении на препарат зародыши мертвых яиц аскаридий в течение 1—3 с окрашиваются в оранжевый цвет. Мертвые яйца описторха и онкосферы бычьего цепня окрашиваются раствором толуидинового синего (1:1000), а мертвые онкосферы бычьего цепня — раствором бриллианткрезилового синего (1:10 000). При этом приобретают цвет зародыши и оболочки как мертвых, так и живых яиц. Поэтому после окраски яйца и онкосферы отмывают в чистой воде и дополнительно окрашивают сафранином (в разведении 1:10 000 10 % раствора спирта). Спирт удаляет краску с оболочек, а сафранин придает им красный цвет. B результате живые яйца окрашиваются в красный цвет, зародыш у мертвых — в синий, а оболочка остается красной. Мертвые зародыши онкосфер бычьего цепня быстро, в течение нескольких минут, окрашиваются в ярко- красный или розовый цвет сафранином либо в синий цвет брилли- анткрезиловым синим в разведении 1:4000 или же индигокармином в разведении 1:1000—1:2000. Живые зародыши не изменяются под влиянием этих красок даже спустя 2—7 ч.

Для определения жизнеспособности яиц карликового цепня рекомендуется использовать следующие краски: 1) бриллианткрезило- вый синий (1:8000) — через 1 ч у мертвых яиц особенно ярко окрашивается онкосфера, которая резко выделяется на бледном или бесцветном фоне остального яйца; 2) сафранин: в разведении 1:8000 при воздействии в течение 2 ч и 1:5000 — в течение 3—5 ч; 3) 50 % раствор пирогалловой кислоты в разведении 1:2 — при воздействии в течение 1 ч при температуре 29—30 0C (чем ниже температура, тем продолжительнее процесс окрашивания).

Живые плероцеркоиды лентеца широкого очень хорошо прокрашиваются водным раствором (1:1000) нейтральрот в течение 5—20 мин. Для получения стойкой розовой окраски, не исчезающей в течение 5 сут и не влияющей на подвижность плероцеркоидов, обычно достаточно 10 мин. Степень окраски контролируют путем просмотра личинок в чистом изотоническом растворе натрия хлорида, для чего плероцеркоидов периодически извлекают из краски. Целесообразно применять метиленовый синий для окрашивания мертвых плероцеркоидов.

Р.Э.Чобанов и др. (1986) предложили методику определения жизнеспособности яиц и личинок гельминтов с использованием в качестве красителя пигмента «рубрин», получаемого при культивировании плесневого гриба Penicillium rubrum. Для этого используют 3 % водный раствор красителя.

Процесс окраски яиц и личинок завершается через 1,5 ч. Нежизнеспособные яйца остриц, бычьего и карликового цепней, анкило- стомид, трихостронгилид приобретают интенсивный розовый цвет, личинки анкилостомид и трихостронгилид — красный. Менее яркая окраска наблюдается у яиц аскарид и власоглавов, так как, выделяясь из кишечника, они уже имеют темно-коричневый ЦВЄТ: Жизнеспособные яйца и личинки не окрашиваются.

Физико-химические методы стимуляции выхода мирацндия из яиц трематод. Методы разработаны С.М.Герман и С.А.Беэром (1984) для определения жизнеспособности яиц описторхов и дикроцелиумов путем воздействия реакционной среды на яйца. Если они живые, происходит выхождение мирацидия. Методы основаны на физикохимической активации железы вылупления мирацидия и стимуляции двигательной активности личинки. Стимуляция достигается воздействием на яйца трематоды специальной реакционной среды в сочетании с последовательными приемами — созданием перепада температур, подсушиванием взвеси яиц, воздействием слабого тока жидкости в исследуемой капле, которые способствуют массовому выходу мирацидиев из яиц.

Определение жизнеспособности яиц описторха по методуГерман, Беэра. Взвесь яиц в воде (водопроводной, отстоявшейся) предварительно охлаждаютдо 10—12 0C. Bce последующие операции осуществляют при комнатной температуре (18—22 0C). B центрифужную пробирку вносят одну каплю (примерно 0,05 мл) взвеси, содержащей 100—400 яиц. Пробирки ставят в штатив на 5—10 мин, чтобы осадить яйца. Затем узкой полоской фильтровальной бумаги осторожно отсасывают излишек воды до полного ее удаления. B пробирку добавляют 2 капли среды, встряхивают, содержимое переносят пипеткой на предметное стекло и оставляют на 5—10 мин, слегка покачивая (или же помещают под фен) для создания слабых токов жидкости в исследуемой капле взвеси. Эта операция, имитирующая перистальтику кишечника моллюска, позволяет активизировать выход мирацидиев. После этого к взвеси добавляют еще 2 капли среды и затем препарат микроскопируют с помощью обычного светового микроскопа (X200). За это время у яиц с жизнеспособным мирацидием должна открыться крышечка, при этом личинка активно выходит в среду. Благодаря наличию в ней этанола мирацидий через 3—5 мин обездвиживается, а затем прокрашивается красителем, находящимся в среде. B итоге легко обнаруживаюти подсчитывают мирацидии.

Приготовление реакционной среды. Среду готовят на 0,05 M трис- HCi буфере в оптимальных режимах pH 8,0—9,5. B буфер добавляют этанол до 10—13 % и краситель (сафранин, метиленовый синий и другие, работающие в пределах pH) до слабого окрашивания жидкости (например, для сафранина его конечная концентрация составит1:50 000). Можно использовать и другой буфер, работающий в щелочных пределах pH, например 0,05 M фосфатный (pH 8,5). Следовательно, среда содержит 96 % этанол — 12 частей; краситель (маточный раствор) — 1—10 частей; 0,05 M трис-HCl буфер (pH 8,5—9,5) — до 100 частей. Пример среды: 12 частей 96 % этанола, 1 часть насыщенного раствора сафранина, остальноедо 100 частей — 0,05 M трис-HCl буфер, pH 9,5.

Определение жизнеспособности яиц дикроцелиума по методу Герман, Беэра, Стратана. Каплю взвеси, содержащую 100—150 яиц трематоды, помещают в центрифужную пробирку на 1—2 мин для осаждения яиц. Затем жидкость осторожно подсушивают с помощью полоски фильтровальной бумаги. Добавляют пастеровской пипеткой 1—2 капли реакционной среды и инкубируют на водяной бане при 28—30 0C 2—3 мин. Состав среды: 6 частей бутанола, 94 части 0,4 % раствора хлорида натрия или 0,3 % раствора хлорида калия в дистиллированной воде. Яйца в среде переносят пипеткой ria предметное стекло и оставляют на 1,5—2 ч при комнатной температуре (18—22 0C), при этом каждые 25—30 мин (по мере подсыхания) добавляют по 1—2 капли (0,05 мл) раствора бутанола в дистиллированной воде. После этого препарат микроскопируют при 100—200- кратном увеличении. Жизнеспособность определяют по числу раскрывшихся яиц с вышедшими мирацидиями. Бутанол проникает через поры оболочки яиц, достигает мирацидиев и активизирует их. Инкубация при отмеченной температуре усиливает этот процесс. Бутанол в концентрации 3—7 % губителен для вышедшего из яйца мирацидия. Перенос взвеси яиц из пробирки на предметное стекло позволяет к моменту выхода мирацидия (через 30^—40 мин) снизить концентрацию бутанола за счет улетучивания до безопасного уровня (1,5—0,5 %). Наличие в среде хлорида натрия в концентрации 0,1— 0,5 % (или хлорида калия в концентрации 0,05—0,4 %) обусловливает активность вышедшего мирацидия. B отличие от мелких прозрачных яиц описторха яйца дикроцелиума имеют темноокрашен- ную оболочку, у них хорошо заметна крышечка, открытая после выхода мирацидия. Поэтому жизнеспособность яиц дикроцелиума удобнее оценивать путем подсчета раскрывшихся яиц, а не окрашивания и подсчета мирацидиев.

Люминесцентный метод исследования яиц и личинок гельминтов. Впервые в гельминтологической практике методы люминесцентной микроскопии были применены B 1955 г. При этом сообщалось, что люминесцентная микроскопия дает возможность дифференцировать живые и мертвые объекты без повреждения яйца. Для флюоресценции использовались не УФ-лучи, а сине-фиолетовая часть видимого света, с обычным микроскопом и предметными стеклами; к осветителю «ОИ-18» применялся специальный набор цветных фильтров.

Было установлено, что живые и мертвые яйца аскарид, остриц, карликовых цепней, бычьего цепня, широкого лентеца и других гельминтов люминесцируют неодинаково. Это явление наблюдается как при первичной люминесценции без применения красителей, так и при окраске флюорохромами (акридиновый оранжевый, корифос- фин, примулин,ауролин,сульфат берлерина, трипафлавин,риванол, акрихин и др.).

Неокрашенные живые несегментированные яйца аскарид светятся ярко-зеленым светом с желтоватым оттенком; у мертвых яиц оболочка излучает зеленый свет значительно ярче, чем темно-зеленая зародышевая; у яиц аскарид с личинкой проявляется только оболочка, а у мертвых и оболочка, и личинка ярко-желтого цвета.

Непигментированные и несегментированные живые яйца остриц и карликовых цепней излучают зеленовато-желтый свет; у мертвых яиц интенсивно люминесцирует оболочка на фоне темно-зеленой зародышевой массы. При вторичной люминесценции (при окраске акридиновым оранжевымвразведении 1:10 000 и 1:50 000от30мин до 2 ч) оболочка живых и мертвых нематод, трематод и цестод люминесцирует неодинаково.

Скорлупа живых и мертвых Ascaris lumbricoides, Toxocara Ieonina, Enterobius vermicularis, Hymenolepis nana, H.fraterna, H. dimi- nuta, T.saginatus, D.latum окрашивается в оранжево-красный цвет. Зародыши живых Asc. lumbricoides, T.leonina, H.diminuta, D.latum и онкосферы бычьего цепня люминесцируюттусклым темно-зеленым или серо-зеленым цветом. Мертвые зародыши этих яиц гельминтов излучают «горящий» оранжево-красный свет. Живые личинки остриц и токсокар (освобожденные от скорлупы яйца) излучают тусклый серо-зеленый свет, при их гибели цвет изменяется OT головного конца в «горящий» светло-зеленый, затем желтый, оранжевый и, наконец, ярко-оранжевый.

При окраске флюорохромами — корифосфилом, примулином — у мертвых яиц аскарид и власоглавов наблюдается свечение от лилово-желтого до медно-красного цвета. Жизнеспособные яйца не люминесцируют, а окрашиваются в темно-зеленый цвет. Живые яйца трематод Paragonimus westermani и Clonorchis sinensis не люминесцируют после окраски акридиновым оранжевым, а от мертвых яиц исходит желтовато-зеленый свет.

Метод люминесценции может быть применен и для определения жизнеспособности личинок гельминтов. Так, флюорохромирован- ные раствором акридинового оранжевого (1:2000) личинки строн- гилят, рабдитат светятся: живые — зеленым (с оттенком), мертвые — ярко-оранжевым светом. Живые личинки трихинелл не светятся или дают слабое свечение при 10-минутной обработке растворами изотиоцианата флюоресцеина, аурамина и др. Флюоро- хромированные мертвые личинки (в концентрации 1:5000) дают яркое свечение.

Живые мирацидии, вышедшие из оболочки, излучают тусклый голубоватый свет с еле заметным светло-желтым венчиком ресничек, но спустя 10—15 мин после гибели проявляются ярким «горящим» светло-зеленым, а затем оранжево-красным светом.

Метод биологической пробы. Биологическая проба — определение жизнеспособности инвазионных яиц гельминтов посредством их скармливания лабораторным животным. Это наиболее точный метод. Личинками гельминта заражают соответствующего промежуточного или окончательного хозяина, можно использовать также лабораторных животных, которым скармливают зрелые яйца или личинки паразитов. Например, для определения жизнеспособных яиц аскаридат (аскариды человека, свиней, токсокары и др.) на 1 животное (морские свинки, мыши) необходимо не менее 100—300 яиц с развившейся личинкой. Яйца аскаридат в изотоническом растворе натрия хлорида вводят пипеткой через рот мыши или морской свинке. Через 6—7 сут животное забивают, вскрывают и исследуют его печень и легкие в отдельности на наличие личинок аскаридат. Для этого печень и легкие измельчают ножницами на мелкие кусочки и исследуют по методу Бермана (см. Гельминтологические методы исследования). Если животных заражали живыми и инвазионными яйцами, то при вскрытии в печени и легких обнаруживают мигрирующие личинки аскаридат. Для определения жизнеспособности адолескариев фасциол, собранных на растениях в биотопах малого прудовика — промежуточного хозяина паразита, используют мышей, морских свинок или кроликов, которым скармливают или вводят эти личинки пипеткой через рот.

B случае заражения яйца фасциол в фекалиях лабораторных животных можно обнаружить у кроликов через 2 мес, у морских свинок через 50 сут, у мышей через 35—40 сут. Для более быстрого получения ответа лабораторных животных вскрывают через 20—30 сут и исследуют печень на наличие молодых фасциол.

Для определения жизнеспособности яиц карликового цепня также рекомендуется их скармливание не зараженным ими ранее белым мышам с последующим вскрытием животных через 92—96 ч и выявлением цистицеркоидов в кишечных ворсинках или цестод в просвете кишечника.