Прямые методы определения кровенаполнения органов

Прямые методы в свою очередь могут быть подразделены на 2 группы. Одни из них основаны на определении содержания в органе собственных компонентов крови: плазмы, эритроцитов или гемоглобина у животных in situ или в перфузате после отмывания органа от крови.

Один из методов определения регионарных фракций ОЦК основан на отмывании органа от крови с последующим определением содержания гемоглобина в перфузате. C этой целью кровь, полученную при перфузии органа, гемолизируют и сравнивают ее экстинкцию при длине волны 810 мкм с гемолизированной кровью, полученной из крупных сосудов. Этот метод в эксперименте используется редко, главным образом из-за ряда существенных недостатков. Одним из них является то, что не может быть гарантировано полное вымывание всей крови, особенно если органы получены у животных с выраженным нарушением органного кровотока и микроциркуляции. В таких условиях часть депонированной крови остается в сосудах, где практически отсутствует кровообращение. Другим недостатком является ограниченное число органов, кровенаполнение которых может быть изучено этим методом, поскольку обязательным условием является наличие магистральных артериальных сосудов, которые снабжали бы изучаемый орган или сегмент тела и не анастомозировали с сосудами соседних областей. Поэтому данный метод применим для изучения кровенаполнения печени, сердца, легких, почек, но не может быть использован для изучения фракций ОЦК в отдельных сегментах туловища, мышцах, костях и т. д.

Тем не менее указанный метод применяется для определения содержания крови в легких в нормальных условиях и при острых изменениях легочного кровотока (Д. П. Дворецкий, 1970, 1971).

Автором, в частности, установлено, что у кошек содержание крови в легких составляет 5,0 ±1,0 мл на 1 кг веса животного, а при увеличении давления в легочной артерии кровенаполнение легких, по данным автора, увеличивается вдвое.

Метод определения кровенаполнения органов и тканей по содержанию в них индуцируемых форм гемоглобина лишен некоторых указанных недостатков (В. А. Бернштейн, 1964). При определении кровенаполнения этим методом гемоглобин, содержащийся во внутренних органах, коже и костях, переводится с помощью раствора соляной кислоты в ацетоне (1 часть 2N HCl на 19 частей ацетона) в солянокислый гематин, содержание которого определяют с помощью фотоэлектрокалориметра по оптической плотности экстракта.

Для определения кровенаполнения мышц гемоглобин крови, содержащейся в них, переводится в карбоксигемоглобин пропусканием через тканевый экстракт газовой смеси с содержанием 60—90% СО. В результате этой процедуры и миоглобин мышц переводится в карбоксимиоглобин. Дальнейший ход определения -состоит в измерении оптической плотности экстрактов на спектрофотометре при длинах волн 568 и 583,8 мкм (оптическая плотность карбоксимиоглобина при этих длинах волн одинакова, а карбоксигемоглобина при длине 568 мкм значительно выше, чем при 583,8 мкм). Дальнейший расчет содержания крови в органах основан на сравнении экстинкции навесок тканей и проб крови, полученных от экспериментального животного. Таким образом, этот метод обладает рядом преимуществ по сравнению с методом вымывания крови из органов, основным из которых является возможность одномоментного изучения топографии объема циркулирующей крови в большом числе сегментов тела. Несмотря на указанные преимущества, он не получил широкого распространения, главным образом из-за внедрения изотопных методов.

Методы разведения радиоактивных изотопов. Наибольшее распространение в отечественной и зарубежной литературе получили методы, основанные на разведении радиоактивных изотопов (меченный I¹³¹ или I¹²⁵ альбумин человеческой сыворотки, меченные Cr⁵¹ или Fe⁵⁹ эритроциты или одновременное использование обоих индикаторов).

Подробное обоснование метода дано впервые Everett с соавт. (1956), которые изучали в опытах на крысах распределение плазмы и эритроцитов.

В связи с тем, что метод разведения меченых альбумина или эритроцитов используют для изучения распределения крови в разных тканях и сегментах тела, большое значение играет способ забоя животных. В большинстве исследований подобного рода животных забивают погружением в жидкие газы (кислород или азот), что позволяет довольно быстро фиксировать кровь в органах, исключает ее посмертное перераспределение и позволяет производить препаровку тканей, не опасаясь изотопного загрязнения (Friedman, 1955; Everett с соавт., 1956). Некоторые исследователи используют для этих целей внутривенное введение насыщенного раствора КС1, что приводит к быстрой остановке сердца в диастоле. Однако этот метод забоя животных представляется нам менее предпочтительным, поскольку препаровка незамороженного трупа чрезвычайно трудна, кроме того, нельзя исключить посмертное перераспределение крови между различными сегментами тела и отдельными органами, поэтому во избежание этого приходится при препаровке тканей быстро накладывать щипцы на нужные сосуды (Dellenback, Muelheims, 1960). Muelheims и соавт. (1959) предложили замораживать ткани для облегчения препаровки после забоя животных введением раствора КС1. При этом необходимо учитывать, что время замораживания различных тканей неодинаково: подкожные ткани замораживаются через 15 с, мозг — через 60 с, кровь в полостях сердца и центральные участки печени — в последнюю очередь.

О. А. Ковалевым (1971) предложено длительное замораживание в холодильной камере трупов животных, забитых введением раствора КС1. Этот метод, с нашей точки зрения, обладает существенным недостатком, поскольку удлинение сроков замораживания погибших животных приводит к неизбежному перераспределению крови между участками тела (перемещение под влиянием силы тяжести, вследствие посмертных сокращений сосудов и гладкой мускулатуры органов брюшной полости, отмечаемых длительное время после остановки сердца).

Как уже указывалось, в качестве индикаторов для определения органных фракций крови чаще всего используют альбумин-1¹³¹ или эритроциты-Cr⁵¹, т. е. препараты, способные длительное время циркулировать, не покидая пределы сосудистого русла. Однако следует иметь в виду, что указанные препараты не являются идеальными индикаторами, поскольку альбумин-1¹³¹ способен выходить в экстраваскулярное пространство, a Cr⁵¹ и Fe⁵⁹ при разрушении эритроцитов выходят в плазму.

Методика определения фракций крови заключается в следующем. После фиксации животных и катетеризации артерии и вены в последнюю вводят индикатор (меченые альбумин или эритроциты). Дальнейшие исследования проводят спустя некорое время, необходимое для смешивания индикатора.

Время, необходимое для полного смешивания индикатора, по данным разных авторов, неодинаково и колеблется от 15 до 1,5 мин (О. А. Ковалев, 1971; Г. С. Мазуркевич с соавт., 1971, 1972; Everett с соавт., 1956; Muelheims с соавт., 1959; Dellen- back, Muelheims, 1960; Aarseth, 1970; Aarseth, Pienne, 1972). По нашему мнению, в опытах на крысах время смешивания не должно превышать 2—1,5 мин, так как оно достаточно для полного смешивания индикатора, если учесть, что у крыс сердечный выброс составляет 25 мл/мин/100 г, что обеспечивает 4—5 полных кругооборотов крови в 1 мин (ОЦК у крыс составляет 5—6 мл/100 г), а периодичность функционирования отдельных капилляров составляет 20—30 с (Johnson, Wayland, 1967).

После смешивания индикатора производится забор крови из артерии (для подсчета радиоактивности и определения объема циркулирующей крови) и крыс забивают погружением в жидкий азот. После замораживания труп препарируют, изучаемые органы и ткани взвешивают и растворяют в горячем 20% растворе КОН. Подсчитывается радиоактивность пробы полученного раствора.

На основании активности стандарта, проб артериальной крови и тканей рассчитывается ОЦК (см. глава III) и содержание крови в органе (V_t), последняя определяется по формуле:

V_{t =} ^Fk'^L (*o/100 мг) (4.1)

Ck

где: V_k — объем пробы крови (в мкл); C_k — активность крови; C_t — активность 100 мг ткани.

Следует отметить, что зарубежные авторы для определения регионарного кровенаполнения используют одновременное раз- ведение в кровеносном русле меченых альбумина и эритроцитов.

Cr⁵¹

хрома раздельно и рассчитывать по соотношению ^₁₃₁ _|_ _{с 5}i

так называемый гематокрит органов, который, по данным большинства исследователей, неодинаков в разных органах. Как правило, гематокрит органов (за исключением селезенки, почки и костного мозга) намного ниже гематокрита тела. Так, по данным Everett с соавт. (1956), при гематокрите тела, равном 36,7, органные величины его колебались от 13,8 (кости) до 50,7 (селезенка). В связи с противоречивой трактовкой этого показателя представляется необходимым остановиться на рассмотрении вопроса о гематокрите органов более подробно.

Как известно, гематокритный показатель используется не только при определении объема крови, его фракций и среднего объема эритроцита, но и для оценки реологических свойств крови, поскольку ее вязкость, особенно в условиях малых напряжений сдвига и малых скоростей, в большой мере зависит от количества эритроцитов и их свойств. Именно поэтому представляется важным определение не только гематокрита крови из крупных сосудов и сердца, но и гематокрита отдельных органов и крови из различных участков микроваскулярного русла. В настоящее время принято различать: а) гематокрит крови из крупных сосудов и сердца; б) истинный гематокрит или гематокрит тела; в) гематокрит крови из различных участков микроваскулярного русла и г) гематокрит органов или тканей.

Гематокрит крови из крупных сосудов определяют центрифугированием ее в капиллярах или специальных пробирках в течение строго определенного времени при известном числе оборотов, обычно 30 мин при 3000 об I мин или 1 мин при 16 500 об I мин (И. А. Кассирский, Г. А. Алексеев, 1971). Ряд исследователей, однако, полагают, что в отношении значений гематокрит- ного показателя существует преувеличенная доверчивость, поскольку разброс показателей в зависимости от различных условий может достигать 10% (Sirs, 1968), это обуславливается не только нарушением режима центрифугирования, но и изменениями свойств эритроцитов, влияющих на плотность их оседания (изменения формы и эластичности, наклонность к агрегации и т. д.).

Истинный гематокрит, как известно, составляет 96—98% гематокрита крови из крупных сосудов, определяемого путем центрифугирования (Gregersen, 1971). Как уже указывалось, поправка, равная 2—4% (микро- или макрогематокрит), вводится для учета объема плазмы, находящейся между эритроцитами после центрифугирования крови. Следует заметить, что согласно математическим расчетам (А. Л. Чижевский, 1959), истинный объем форменных элементов должен быть меньше объема, определяемого центрифугированием, на И—12%, так как эритроциты при центрифугировании укладываются более рыхло, нежели это возможно в соответствии с их геометрией. Однако указанные расчеты еще нуждаются в проверке.

Если гематокрит крови из крупных сосудов и сердца примерно одинаков, то гематокрит крови из различных участков терминального отдела сосудистого русла различен, на что указывают как прижизненные микроскопические наблюдения кровотока в мелких сосудах, так и модельные опыты. Установлено, что содержание эритроцитов в ветвях сосудов не одинаково, а зависит от угла ветвления их и объясняется своеобразным распределением плазмы и эритроцитов по отношению к просвету основного сосуда (Gelin, 1964). В условиях значительных нарушений гемодинамики, например, при шоке, часть капилляров может вообще не содержать форменных элементов (плазматические капилляры), в то время как другие оказываются целиком заполненными эритроцитами или их агрегатами (С. А. Селезнев, 1971а, б).

Методы исследования гематокрита крови из крупных сосудов и сосудов различных отделов микроваскулярного русла в различных физиологических условиях достаточно понятны, и результаты их согласуются с другими данными по физиологии кровообращения и обмену жидкости на участке «сосуд—ткань». Попытки же оценить гематокрит крови из отдельных органов, с нашей точки зрения, нельзя признать удачными.

В настоящее время общепринято считать, что гематокрит крови из крупных сосудов отражает суммарный состав фракций крови, оттекающей от различных органов и имеющей неодинаковое содержание эритроцитов. К сожалению, мы не нашли работ, в которых бы гематокрит крови, оттекающей от строго изолированных органов или ограниченных их участков (без сосудистых анастомозов), оценивали путем центрифугирования проб крови. Единичные же исследования по определению гематокрита крови из различных участков сосудистого русла не выявили существенных колебаний в объеме эритроцитов. В частности, у людей гематокрит крови из плечевой артерии, верхней полой вены, плечевой вены и крови, полученной пункцией пальца, составил, соответственно, 34,73, 37,61, 37,83 и 37,06% (Moster с соавт., 1968). Для суждения о гематокрите отдельных тканей или органов в эксперименте используется радиоизотопный метод, основанный на одновременном введении в кровеносное русло эритроцитов, меченных Cr⁵¹, и альбумина человеческой сыворотки, меченного I¹³¹ или I¹²⁵. Сущность метода состоит в том, что после полного смешивания эритроцитов и альбумина забирают пробы крови для подсчета в ней радиоактивности хрома и йода. После же забоя животных (замора

живанием в жидком азоте или введением хлористого калия) определяют активность этих элементов в пробах тканей и органов. На основании полученных данных рассчитывают содержание эритроцитов и плазмы в органах. Гематокрит органов (H₀) равен:

Определение гематокрита органов этим методом показало, что в большинстве из них (за исключением селезенки, костного мозга и, в меньшей степени, кожи) он намного ниже гематокрита тела и колеблется от 13,8 до 36% (табл. 6). На первый взгляд, представляется маловероятным, что кровь, оттекающая от кожи и селезенки, на долю которых приходится менее 10% сердечного выброса, может компенсировать гемодилюцию, дол-

Таблица 6

Средние значения гематокрита органов и органных фракций сердечного выброса у крыс

жную неизбежно возникнуть при смешивании крови остальных органов, поскольку гематокрит тела является средней величиной гематокрита фракций крови, оттекающей от всех органов и тканей. Следовательно, на основании величин органных фракций сердечного выброса и гематокрита органов представляется возможным проверить совпадение значений фактического и расчетного гематокрита.

Если гематокрит органов определен верно, то должно соблюдаться равенство:

где: H_t—гематокрит тела; H₀ — гематокрит органа или ткани; р — фракция сердечного выброса, приходящаяся на данный орган или ткань (в %).

Нами было проверено соответствие величины гематокрита тела, полученной экспериментально, должному (расчетному), определяемому с учетом органных фракций сердечного выброса и гематокрита органов (по данным радиоизотопного метода). Для этого были использованы значения гематокрита тела и органов, заимствованные из работы Everett с соавт. (1956), и величины фракций сердечного выброса, определяемые методом разведения радиоактивных микросфер, по данным Forsyth с соавт. (1968), Kaihara с соавт. (1968) и др. (см. табл. 6).

Расчет гематокрита тела с использованием данных таблицы показал, что он должен составлять 29,6%, что намного меньше его фактической величины (36,7%). Можно было предположить, что эта разница определяется неучтенной долей сердечного выброса (100—96,2 = 3,8), имеющей кровь с большим содержанием эритроцитов. Однако расчеты показывают, что даже если указанная фракция сердечного выброса будет содержать 99,5% эритроцитов (что маловероятно), то и в этом случае гематокрит тела не достигнет фактического значения и будет составлять лишь 32,2%.

Представленные материалы свидетельствуют о том, что если от органов оттекает кровь с гематокритом, равным так называемому гематокриту органов, определяемому изотопным методом, то гематокрит смешанной крови должен быть значительно меньше фактического, получаемого путем центрифугирования.

Непонятны и многие другие факты, в частности низкий гематокрит крови легких, в то время как кровь крупных сосудов содержит значительно больше эритроцитов. Если признать справедливой разницу между гематокритом тела и селезенки в 14% (50,7—36,7%), то при производительности сердца у крыс 25 мл/мин/ІОО г тела (Bullard, 1959; Sapirstein с соавт., 1960; Kovacs с соавт., 1967) и селезеночной фракции выброса даже в 1 % следует ожидать, что все эритроциты у животного весом 200 г будут задепонированы в селезенке за 142 мин, что противоречит достоверно доказанной скорости обмена эритроцитов — 0,8% в сутки (И. А. Кассирский, Г. А. Алексеев, 1971). Не исключено, что высокий гематокрит крови селезенки мог быть обусловлен нефизиологическим депонированием меченых эритроцитов, которые повреждаются в процессе метки и центрифугирования их при отмывке.

Таким образом, несовпадение фактических и расчетных значений гематокритного показателя органов скорее всего обусловлено методическими погрешностями определения. Использование для определения регионарных фракций ОЦК и гематокрита органов одновременного разведения меченых эритроцитов и плазмы, как указывалось выше, базируется на двух основных допущениях: 1) меченые эритроциты и альбумин не выходят за пределы сосудистого русла и их поведение в кровотоке соответ-

ствует поведению собственных форменных элементов и плазмы животного, которому они вводятся; 2) соотношение хрома и йода в органах соответствует соотношению эритроцитов и плазмы в них.

Справедливость этих допущений представляется нам сомнительной, поскольку при подсчете радиоактивностей хрома и йода регистрируется не соотношение содержания эритроцитов и плазмы в сосудистом русле, а соотношение активностей этих изотопов в органе. В случае же выхода одного из указанных изотопов за пределы сосудистого русла значения гематокрита будут либо завышенными (при выходе хрома), либо заниженными (при экстравазации йода). К настоящему времени имеется достаточно данных о том, что альбумин весьма быстро покидает сосудистое русло и накапливается за его пределами. Так, Tuck- man и соавт. (1959) вводили людям одновременно меченые эритроциты и альбумин и рассчитывали прямой (по йоду) и непрямой (по хрому) объемы плазмы. Оказалось, что уже через несколько минут после начала смешивания введенных препаратов отмечалась разница между прямым и непрямым объемами плазмы (прямой объем намного превышал непрямой). Причинами этого авторы считают либо быстрый выход альбумина в экстраваскулярное пространство, либо существование внутрисосудистых областей с низким гематокритом.

Показано (Sclar с соавт., 1968), что объем крови в головном мозге (0,027 мл!г) при определении его с помощью меченого альбумина значительно выше, чем при измерении его с помощью меченых эритроцитов (0,019 мл/г). Авторы связывают это расхождение с выходом альбумина в ткань мозга или с низким гематокритом крови из сосудов мозга, однако доказательств в пользу второй возможности они не приводят. В СВЯЗИ C этим необходимо отметить, что наличие на уровне терминального отдела русла сосудов с низким гематокритом крови не может быть причиной низкого гематокрита органов в целом, так как в них существуют сосуды с более высоким содержанием эритроцитов, компенсирующие локальную гемодилюцию.

В недавних исследованиях на кошках (Johnson, 1971) показано, что гематокрит для капилляров брыжейки, отходящих от артериального конца метартериол, меньше, нежели для капилляров, отходящих от венозного отдела. В самих же метар- териолах по мере отхождения от них капилляров величина гематокрита все более возрастает. Это и понятно, поскольку через орган в обычных условиях жизнедеятельности должны пройти все форменные элементы и плазма, поступающие по артериальным сосудам.

Показано (Kompf с соавт., 1971), что I¹³¹ после внутривенного введения меченого альбумина крысам и кроликам обнаруживается не только внутри сосудов почек, но распределяется также в интерстициальном пространстве и внутри клеток коркового вещества. Эти данные ставят под сомнение справедливость концепций не только о внутрисосудистом, но и об экстра- целлюлярном распределении альбумина. Так, по нашим данным, концентрация альбумина в крови крыс после его внутривенного введения снижается за 1,5 ч на 30% (Г. С. Мазуркевич с соавт. 1971), что свидетельствует о выраженной экстраваза- ции этого индикатора.

Таким образом, представляется весьма вероятным, что определение соотношения радиоактивностей хрома и йода в тканях не свидетельствует о гематокрите крови в них, а отражает отношение активности хрома, находящегося в сосудистом русле, к активности йода, находящегося как в сосудах, так и за пределами их. В связи с выходом альбумина за пределы сосудистого русла это отношение может быть меньшим, нежели истинный гематокрит крови органов.

Косвенным подтверждением сказанному служит связь между степенью снижения гематокрита органов (по сравнению с гематокритом тела) и строением капилляров различных органов. В частности, по данным Everett с соавт. (1956), наиболее малый гематокрит характерен для крови костей, почек и надпочечников, а приближающийся к значениям гематокрита тела — для крови мышц и легких. В связи с этим интересно отметить, что эндотелий капилляров почек и надпочечников имеет интрацеллюлярные фенестры или перфорации, а в капиллярах легких и мышц их нет (Bennet с соавт., 1959). В то же время известно, что переход во внесосудистое пространство частиц размером до 7—9 нм (диаметр сывороточного альбумина равен 7 нм) осуществляется именно через фенестры или межклеточное пространство (А. А. Войткевич, И. И. Дедов, 1972; Karnov- sky, 1971; Renkin, 1971).

Таким образом, вопрос о так называемом гематокрите органов крайне запутан. Существование же различного гематокрита в разных сосудистых зонах нельзя считать строго доказанным. Информация о гематокритном показателе, получаемая с помощью метода разведения меченых эритроцитов и альбумина, не отражает истинного содержания эритроцитов в органе, поскольку альбумин способен покидать сосудистое русло и депонироваться за его пределами (в том числе и внутриклеточ- но). Это создает ложное представление об увеличении объема плазмы в органах и способствует занижению величин гемато- критного показателя.

Неясным остается вопрос о том, идентичен ли гематокрит органов гематокриту оттекающей от них крови. Очевидно, что гематокрит притекающей и оттекающей от органов крови должен быть одинаковым, поскольку в тканях нет ни источника эритроцитов, ни источника жидкости, которая постоянно вызывала бы гемодилюцию. Трудно представить и механизмы, которые могли бы быть ответственными за регуляцию содержания эритроцитов «на выходе» крови из органа и которые поддерживали бы в нем гематокрит более низкий, нежели в оттекающей крови. В этом аспекте представляется сомнительной справедливость гипотезы, объясняющей снижение гематокрита органов разбавлением крови в их сосудах; недостаточно аргументировано и введение понятия об F-клеточном факторе (Gre- gersen, 1971), в основе которого лежит предположение о более низком гематокрите тела по сравнению с кровью крупных венозных сосудов.