Неравновесные состояния белков и их релаксация

В литературе имеется много работ, посвященных конформацион- но неравновесным состояниям белков (ферментов) после локального возмущения. Помимо простой регистрации, была исследована ки­нетика релаксации, а также их физические и химические свойства в промежуточных состояниях во время конформационной релаксации.

Есть два главных метода получения металлсодержащих белков в неравновесных состояниях.

Для получения и сохранения неравновесных форм металлсодер­жащих белков и исследования их спектральных и магнитных свойств была разработана специальная техника низкотемпературного восста­новления [38]. В этом методе содержащая металл простетическая группа¹^ восстанавливается в замороженном водном растворе при температуре жидкого азота с помощью радиолиза. При этом обра­зуются термолизованные²) электроны. Исходные препараты предста­вляют собой белки, активные центры которых могут существовать как в окисленной, так и в восстановленной формах.

После электронного восстановления активного центра возникают кинетически стабилизированное неравновесное состояние. Атом метал­ла в активном центре восстановлен, но его непосредственное окруже­ние изменено настолько, насколько это позволяет замороженная в ма­трице и поэтому не изменившаяся глобула. Непосредственное окруже­ние активного центра претерпевает колебательную релаксацию, но про­странственная структура глобулы остается той же, какой она была в рав­новесном окисленном белке. Однако новое состояние активного центра и его ближайшего окружения должно в условиях равновесия соответ­ствовать конформации всей белковой глобулы. Напряжение между из­мененным активным центром и остальными частями макромолекулы приводит к изменению спектральных и магнитных характеристик ак­тивного центра.

С повышением температуры можно наблюдать релаксацию не ре- лаксировавшей части глобулы к новому равновесному состоянию.

«Простетическая» — небелковая часть фермента. Обычно играет роль активного центра.

«Термолнзованные* — находящиеся в термодинамическом равновесии с термоста­том.

Температура релаксации определяется природой белка и свойствами матрицы.

Конформационно неравновесные состояния белков (и не только металлсодержащих) могут быть получены в растворе при комнатной температуре с помощью следующих методов:

i. Восстановление иона металла микросекундными (или более ко­роткими) импульсами быстрых электронов или ароматическими анион-радикалами, образуемыми из соответствующих соединений с помощью вспышек света короткой длительности.

ii. Флаш-фотолиз гем-содержащих белковых комплексов с О₂, CN^-,

N0.

iii. Скачкообразное добавление субстрата, ингибитора или другого специфического лиганда к равновесному белку, а также скачко­образное изменение pH или ионной силы.

Мы выберем в качестве примера «почетный фермент» —- гемогло­бин. Строго говоря, гемоглобин не является ферментом, его функция

Рис. 4.8. Упрощенная схема активного центра гемоглобина. Структура гема и присоединение кислорода к железу гема

заключается в переносе О₂ от легких к тканям и СО₂ от тканей к легким. После локального возмущения, однако, он ведет себя точно так же, как и ферменты.

Рис. 4.8 представляет упрощенную схему молекулярной структуры гемоглобина.

Молекулы гемоглобина со­стоят из 4-х субъединиц: двух a и двух р и, соответственно, со­держат 4 полипептидные цепоч­ки двух типов. Каждая а-цепочка содержит 141, а /3-цепочка —

Рис. 4.9. Кривые оксигенации гемоглобина (а) и миоглобина (Ь)

146 аминокислотных остатков. Вся молекула гемоглобина содержат, таким образом, 574 аминокислот.

Строго говоря, эти детали струк­туры относятся не к гемоглобину, а к его белковому компоненту — глобину. Каждая субъединица глобина содержит одну небелковую (про- стетическую) группу — гем: комплекс порфирина с Fe²⁺. Структура гема показана в верхней части рис. 4.9. Атом железа может образовать шесть координационных связей. Четыре связи направлены к атомам азота порфиринового кольца, а оставшиеся четыре связи — перпен­дикулярны к плоскости кольца по обе ее стороны. Гемы расположены вблизи поверхности белковой глобулы в специальных «карманах», образованных складками полипептидных цепочек глобина. Нормально функционирующий гемоглобин существует в одной из трех форм: фер­рогемоглобин (называемый также дезоксигемоглобином или просто гемоглобином), оксигемоглобин и ферригемоглобин (метгемоглобин). Ион железа в феррогемоглобине находится в восстановленной форме Fe²⁺, одна из двух связей, перпендикулярных к плоскости кольца, соединяет железо с атомом азота гистидинового остатка, другая связь свободна (нижняя часть рис. 4.9). Взаимодействие молекулярного ки­слорода со свободным гемом приводит к окислению иона железа

(Fe²⁺ ------- >Fe³⁺). В случае феррогемоглобина глобин предохраняет

железо гема от окисления.

Мышечные ткани содержат миоглобин, который, грубо говоря, является четвертушкой гемоглобина. Миоглобин имеет только одну субъединицу, структура которой идентична структуре ft субъединицы гемоглобина. Миоглобин связывает кислород значительно сильнее, чем гемоглобин, и служит кислородным депо при недостатке кислорода.

Обратимое присоединение кислорода (оксигенация), которое по­зволяет гемоглобину выполнять его основную функцию, обусловлено возможностью образования сильных пятой и шестой координационных связей и способностью переносить электрон к кислороду от гистидина, а не от железа, т.е. без окисления Fe²⁺ (см. рис. 4.8).

Как уже было сказано выше, молекула гемоглобина содержит четыре субъединицы и, следовательно, четыре гема, каждый из кото­рых может присоединить одну молекулу кислорода. Поэтому реакцию оксигенации можно разделить на четыре стадии:

На рис. 4.9 представлена типичная S-образная кривая оксигена­ции гемоглобина (кривая а) и гиперболическая кривая оксигенации миоглобина (кривая Ь). Последняя соответствует более прочному свя­зыванию кислорода активным центром миоглобина.

В отличие от миоглобина, гемоглобин на начальных стадиях ок­сигенации обладает низким сродством к кислороду, и равновесие в реакции (4.17) сдвинуто влево. Затем кривая становится круче и при высоких значениях рО₂ достигает насыщения. Это типичный эффект кооперативности.

Активность многих ферментов скачкообразно изменяется от одно­го значения к другому под действием некоторых низкомолекулярных агентов, которые не принимают непосредственного участия в катали­тическом акте [39].

Это явление называется аллостерическим эффектом. Такие фер­менты могут существовать в разных конформациях с различными активностями. Эти конформации находятся в динамическом равнове­сии. Присоединение низкомолекулярного агента смещает равновесие

и меняет поэтому активность фермента. К этому же классу белков принадлежит и гемогло­бин.

Рис. 4.10. Четвертичная структура молекулы гемоглобина

На рис, 4.10 представлена схема четвертичной структуры двух конформационных состо­яний гемоглобина.

субъединиц. В форме Т (от английского “tense”) гемы расположены в узких карманах глобулы и присоединение кислорода затруднено. В форме R (от английского “rapid”) атомы железа гема открыты и присоединение кислорода облегчается.

Конформационный переход Т ------------ ► R включает не только измене­

ние четвертичной структуры белковой глобулы. Релаксация затрагивает все части четырех субъединиц. Чтобы понять последовательность собы­тий в ходе релаксационного процесса, рассмотрим основные физиче­ские характеристики трех главных форм гемоглобина. Они приведены на рис. 4.11.

В равновесном гемоглобине ион железа (Fe²⁺) лежит вне пор- фиринового кольца (примерно на 1 А). Он имеет четыре электрона и магнитный момент, равный 5,5 Боровских магнетонов. Оптичес­кий спектр поглощения имеет широкую полосу с Л_мах = 5,56 нм. В равновесном оксигемоглобине ион железа (Fe²⁺) находится точно в плоскости порфиринового кольца, все электроны спарены (оксиге­моглобин диамагнитен). В спектре оптического поглощения видны две характеристические полосы при 542 и 576 нм. В ферригемоглобине (метгемоглобин) при нейтральных значениях pH молекула кислорода замещается молекулой воды, не связанной химически с ионом железа (Fe³⁺). Ион железа лежит значительно ближе к порфириновому кольцу, чем в феррогемоглобине (почти в плоскости), имеет пять неспаренных электронов и магнитный момент равный 5,91 Боровских магнетона. Спектр поглощения в видимой области не имеет выраженных харак­теристических полос.

Рис. 4.11. Физические свойства основных производных гемоглобина

Структурные изменения в активном центре (вблизи гема) приводят также к значительным изменениям пространственной структуры всего белка. После присоединения кислорода (Т ► R-переход), некото­

рые аминокислотные остатки сдвигаются на ~ 7 А.

Рассмотрим последовательность во времени таких структурных изменений, используя в качестве примера быстрое электронное вос­становление ферригемоглобина.

Прежде всего подведем итог и суммируем основные структурные характеристики равновесных форм главных производных гемоглобина.

Рис. 4.12. Спектры поглощения неравно­весного феррогемоглобина (1), равновес­ного феррогемоглобина (2) и равновесного ферригемоглобина (3) в замороженных рас­творах при 77 К

В феррогемоглобине пентакоординированный ион Fe²⁺ находит­ся в высоко-спиновом состоянии (S = 2) и значительно смещен от плоскости порфиринового кольца. Присоединение О₂ (как и СО или N0) сопровождается переходом железа гема в низко-спиновое состояние (S = 0) и смещением атома железа в плоскость порфирино­вого кольца. В то же время структура активных центров в равновесном высоко-спиновом ферригемоглобине такова же, как и в низко-спи­новом феррогемоглобине: ион железа находится почти в плоскости порфиринового кольца. Это же справедливо и для соответствующих производных миоглобина. Подробное теоретическое обсуждение этих структурных характеристик можно найти в [40].

После восстановления ферригемоглобина в замороженной матри­це быстрыми электронами более 80 % белка находится в неравновесной восстановленной низко-спи­

новой форме, характеризу- ющейся спектром поглоще­ния типа «оксигемоглобина»

(рис. 4.12). Повышение тем­пературы приводит к релак­сации неравновесного фер­рогемоглобина в равновесное состояние со спектром, по­казанным на рис. 4.12 (кри­вая 2). Аналогичные эффек­ты наблюдались для комплек­сов ферригемоглобина с раз­личными лигандами: фтор, азид, цианид, имидазол или ОН^- (pH 8,5). Восстановле­ние этих комплексов в замо- ,[х>женных растворах приво­дит к образованию со 100%

выходом неравновесных восстановленных форм белка со спектрами поглощения и магнитного кругового дихроизма соответствующих низ­ко-спиновых равновесных форм производных феррогемоглобина.

Анализ этих данных говорит о том, что образование низко-спино­вых неравновесных форм феррогемоглобина и его комплексов, после низкотемпературного восстановления ферригемоглобина и его ком­плексов, обусловлено сохранением аксиальных лигандов в шестом координационном положении иона Fe²⁺. Это положение, по всей видимости, занято атомом азота в имидозольном остатке дистального гистидина. Диссоциация лиганда блокирована стерическими препят­ствиями белковых групп вокруг гема.

Те же результаты были получены с ферримиоглобином и его комплексами.

Образование неравновесных форм многих металлсодержащих бел­ков в замороженных растворах быстрыми электронами было зареги­стрировано при низкотемпературном восстановлении с использова­нием различных физических методов (оптическое поглощение, ЭПР, магнитный круговой дихроизм). Все ссылки можно найти в моногра­фиях [1,4,31].

Как уже было отмечено, конформационно неравновесные состо­яния всех исследованных белков с повышением температуры релак- сируют к соответствующим равновесным состояниям еще до размо­раживания матрицы. В некоторых случаях удалось установить по­следовательность структурных перестроек. Было найдено, например, что перед удалением аксиального лиганда из координационной сферы атома железа его ориентация меняется и атом железа удаляется от пор­фиринового кольца. Дальнейшая релаксация проходит через несколько промежуточных состояний.

Данные об образовании конформационно неравновесных состо­яний железосерных белков, играющих важную роль во внутрикле­точной трансформации энергии, будут рассмотрены позже. В конце этого параграфа будут описаны различные методы получения не­равновесных форм белков в растворах при комнатной температуре. До настоящего времени этой техникой было исследовано несколь­ко сотен белков, зарегистрирована кинетика их релаксации и уста­новлены их физические и химические свойства. Здесь будут да­ны только принципиальные выводы из результатов этих исследова­ний. Ссылки на соответствующие публикации можно найти в кни­гах [1,31,37,41].

Анализ приводит к следующим важным выводам:

1. Во всех случаях быстрого локального возмущения активного цен­тра белка (фермента) возникает неравновесное состояние, которое релаксирует путем конформационных изменений, охватывающих всю белковую глобулу. В ходе этих изменений молекула белка проходит через множество промежуточных, неравновесных состо­яний, переходы между которыми могут занимать от микросекунд до сотен миллисекунд. Специфическая химическая активность мо­лекулы белка (например, ферментативная активность), как прави­ло, в этих промежуточных неравновесных состояниях выше, чем в исходном и конечном равновесных состояниях.

2. Акт превращения субстрата в продукт совпадает с одной из стадий конформационной релаксации белка.

Несколько примеров. Для многих белков были измерены при комнат­ной температуре характерные времена различных стадий релаксации после скачкообразного восстановления иона железа в активном цен­тре [41]. Для цитохрома С (один из главных компонентов дыхательных электрон-транспортных цепей в митохондриях аэробных организмов), при pH 10,6 были зарегистрированы три релаксационные стадии с ха­рактерными временами, около 50 мкс, 0,5 мс и 0,3 с. Для гемоглобина при pH 7,4 масштабы времени обнаруженных релаксационных стадий были: 70 мкс, 0,3 мс, 0,6 мс и 50 мс. Для железосерного белка — фер- редоксина были зарегистрированы две четкие стадии с характерными временами около 100 мкс, 0,2 с.

Достаточно большие времена жизни металлсодержащих белков в конформационно неравновесных состояниях делают возможным оценить их химическую реакционную способность. Измерили кон­станты скорости некоторых специфических реакций этих белков сразу после образования их неравновесных состояний и в течение релак­сации. Были подробно исследованы следующие реакции: окисление восстановленных железосодержащих белков феррицианидом калия или некоторыми металлсодержащими белками в окисленной форме.

Главным результатом этих кинетических исследований было то, что константы скорости реакций белков в неравновесных состояниях могут отличаться существенно (вплоть до 10³ раз) от соответствующих констант скорости тех же белков в равновесных состояниях. Реакцион­ная способность обычно повышена (но не всегда). После релаксации константы скорости возвращаются к значениям, характерным для рав­новесных белков.

Скорости реакций неравновесных белков часто имеют необычную зависимость от температур. Начальная конфигурация и скорость кон­формационной релаксации белков, как правило, более чувствительны к изменениям температуры, чем скорость элементарного акта исследу­емого химического превращения. Поэтому, например, с понижением температуры конформационная релаксация замедляется и большая часть реакции успевает закончиться на первых стадиях релаксации, когда реакционную способность белка максимальна. Измеряемая ско­рость реакции в этом случае возрастает в кажущемся противоречии с законом Аррениуса.

Описанные выше исследования белков в конформационно нерав­новесных состояниях требуют сложной экспериментальной техники: низкие температуры для замедления релаксации, импульсные мето­ды для одновременной реализации локальных химических изменений в значительной части молекул белка в образце и т.д. Совершенно ясно, однако, что аналогичные события могут иметь место и с отдельными молекулами белка во время их функционирования при физиологи­ческих температурах, без искусственно навязанной синхронизации. Полученные до сих пор данные доказывают, что многие реакции белков действительно протекают в две главных стадии: быстрые ло­кальные изменения с последующей медленной релаксацией, в ходе которой белковые молекулы проходят через серии существенно не­равновесных состояний и реализуют (для ферментативных процессов) трансформацию субстрата в продукт.

Релаксация неравновесного состояния, специально приготовлен­ного с помощью направленного, локального воздействия, может быть с одинаковой степенью обоснованности описана либо как после­довательностью элементарных актов, каждый из которых протекает обратимо и переводит молекулу в новое конформационное состояние (см. рис. 4.6 и 4.7), либо как непрерывное движение вдоль выделенной механической степени свободы. В случае достаточно простых моле­кул предпочтителен первый подход. Во время релаксации сложных

белковых молекул элементарные акты (повороты вокруг простых кова­лентных связей, изменения некоторых валентных углов, разрыв и обра­зование водородных связей и т. д.) должны быть реализованы в строго определенной последовательности с помощью правильных и ошибоч­ных элементар ных актов. Если число возможных элементарных актов достаточно велико, то описание релаксационного процесса становит­ся неудобным, практически невозможным и поэтому бессмысленным, как, например, микроскопическое описание любого макроскопичес­кого движения.

Исследование превращения субстрата в продукт и конформационной ре­лаксации во время одного оборота ферментативной реакции [42]. Ис­следовали прямую и обратную реакции, катализируемые растворимым ферментом малатдегидрогеназой (МДГ) с коферментом NAD:

Конформационные изменения МД Г изучали, измеряя (пикосе­кунд ,ная техника) среднее время жизни собственной флуоресценции триптофана (ту), которая чувствительна к его непосредственному окру­жению. Значение Ту измеряла каждые 0,5 мс в течение 1,5 оборота белка (~ 10 мс для прямой реакции). Химическую трансформацию субстрата детектировали по изменениям редокс состояния кофермен­та, измеряя оптическую плотность образца при 340 нм (максимум поглощения NADH) каждые 0,5 мс, начиная с 0,5 мс после смешива­ния. Присоединение L-малата или оксалацетата не меняет значения Ту МД Г, но образование комплексов с коферментами NAD⁺ или NADH понижает Ту при 20° С от примерно 3,6 нс до ~ 3,1 нс в течение ~ 4 мс после смешивания. На рис. 4.13 а представлены значения Ту и кинетика восстановления NAD⁺ при 20° С в течение 14 мс после смешивания. Если реакция была инициирована добавлением L-малата к смеси МД Г и NAD⁺, Ту немедленно начинает уменьшаться, достигая минимального значения (~ 2,5 нс) при ~ 6^0 мс после смешивания. В конце первого цикла (через ~ 10,5 мс) Ту возвращается к своему

Рис. 4.13. а) Кинетика изменений оптической плотности NADH, D_M0 (кривая 3) и изменений ту после ини­циирования прямой реакции. Кри­вая 1: реакция инициирована до­бавлением субстрата к смеси фер­мент + кофермент. Кривая 2: реак­ция инициирована добавлением сме­си кофермент + субстрат к фер­менту. 6} Кинетика изменений D₃₄₀ и ту после инициирова ния обрат­ной реакции. Обозначение те же, что и на рис. 4.13 а

первоначальному значению, характерному для МД Г—NAD⁺, а затем снова уменьшается, хотя и медленнее., чем в начале первого цикла. Если реакция была инициирована добавлением NAD⁺ к смеси МДГ с L-малатом или добавлением смеси NAD⁺ с L-малатом к МД Г, то кривая Ту (0 в течение первых 4 мс проходит выше соответствую щей кривой для первой схемы опыта, после чего обе кривые совпадают'.

При 5° С для обеих схем и инициаций Ту уменьшается в течение 14 мс после смешивания и не достигает своего минимального значения до конца регистрации.

Совершенно другие результаты были получены для обратной ре ­акции (восстановление оксалацетата и окисления NAD⁺). Эти резуль­таты показаны на рис. 4,13 Реакция практически не сопровождается конформационной релаксацией, регистрируемой по уменьшению Ту, а окисление NAD⁺ начинается сразу после смешивания и продолжает­ся в течении нескольких оборотов фермента (время оборота фермента для обратной реакции примерно 3 мс).

Все эти результаты можно рассматривать как доказательства того, что МДГ катализирует прямую и обратную реакции, нахо­дясь в различных конформационных состояниях. Пути этих реакций не совпадают.

Эти данные могут также прояснить механизм «гистерезиса» или «памяти» ферментативной активности. Существуют две возможности гистерезисного поведения таких белков.

1. Постепенное возрастание активности каждой молекулы фермента с каждым новым оборотом.

2. Возрастание числа активных молекул белка в популяции первона­чально неактивных молекул фермента.

Из выше представленных данных следует, что в первом цикле оборота фермента участвует лишь незначительная часть молекул МДГ (~ 0,1 %), но все эти молекулы обладают максимальной активностью с самого начала. Это типичное поведение гистерезисных ферментов, которые могут существовать в двух дискретных состояниях — активных и неактивных.

В ходе реакции число активных молекул возрастает. Каждая ак­тивная молекула фермента, принимая участие в акте превращения субстрата в продукт, выводится из популяции потенциально активных, но не реагировавших молекул. Поэтому равновесие между двумя по­пуляциями смещается и число активных молекул фермента возрастает.

4.7.