3.3.1. Модификация методики выделения и очистки ДНК малины и ежевики

На начальном этапе нам не удавалось добиться амплификации препаратов ДНК малины и ежевики, полученных с использованием методики выделения тотальной ДНК Дорохова и Клоке (1997). Поэтому возникла необходимость модификации данной методики с целью получения препаратов ДНК малины и ежевики высокого качества, с низким содержанием фенольных соединений и полисахаридов, пригодных для постановки ПЦР.

В процессе работы в данную методику мы включили ряд модификаций: (1) проведение дополнительной обработки смесью хлороформ/ изоамиловый спирт (24:1) в присутствии метабисульфита калия, (2) очистка препаратов ДНК при помощи поливинилполи-пирролидона (PVP) и (3) дополнительное переосаждение ДНК при помощи цетилтриметилбромид аммония (СТАВ). C помощью этих модификаций были получены препараты ДНК с низким содержанием фенольных соединений и полисахаридов; их высокое качество было подтверждено электрофорезом (недеградированные препараты ДНК) и спектрофотометрическим анализом. Это позволило нам в дальнейшем провести успешные постановки ПЦР.

Необходимо отметить, что ранее для видов рода Rubus методика Дорохова и Клоке (1997) уже была модифицирована (Соболев, 2004). Данная модификация включала целый ряд этапов: дополнительную обработку препаратов фенол/хлороформом; внесение в экстракционный буфер 2-меркаптоэтанола и о- третбутилоксианизола; замену спиртового осаждения ДНК на осаждение 20%-ным ПЭГ-6000; доочистку препаратов ДНК в LiCl (Соболев, 2004).

Модифицированная методика выделения и очистки ДНК, разработанная нами, значительно проще в использовании и требует меньших временных затрат.

3.3.2.