УФ-индуцированные изменения функциональных свойств мем-брапосвязанной Na+, КР-АТФазы в присутствии фосфолипазы D

На рис. 48 представлены данные по исследованию фоточув­ствительности мембраносвязанной Na⁺, К⁺-АТФазы при воздей­ствии УФ-излучения (240—390 нм) в дозах 1,5 и 3,0 кДж/м^й на интактные мембраны эритроцитов человека.

Рис. 48. УФ-индуциро­ванные изменения функци­ональной активности Na⁺, К⁺-АТФазы эритроцитарных мембран, модифицирован­ных фосфолипазой D: 1 — УФ-облучение интактных мембран; 2 — УФ-облучение модифицированных фосфо­липазой мембран

В состав активного центра Na⁺, К⁺-АТФазы входят высоко­реакционноспособные остатки тирозина и цистина, поглощение УФ-света которыми обусловливает процесс фотомодификации фермента.

Воздействие длинноволнового УФ-света в интервале длин волн 320—390 нм (X_mnx - 365 нм) в течение 30 мин приводит к полному ингибированию ферментативной активности Na⁺, К⁺-АТФазы. Хро­мофорами УФ-света в этом диапазоне длин волн являются различ­ные (восстановленные) пиридиннуклеотиды, флавины, железопор- фирины. Таким образом, инактивация мембраносвязанного фер­мента в данном случае может быть обусловлена фотохимическими превращениями вышеназванных хромофоров. Не исключена веро­ятность локализации этих акцепторов УФ-излучения на мембране в непосредственной близости к исследуемому белку. Вместе с тем, учитывая то обстоятельство, что хромофорные группы мембран (порфирины, флавины, нуклеотиды) выступают в качестве сенсиби­лизаторов пероксидного окисления липидов, можно предположить, что в процесс модификации Na⁺, К⁺-АТФазы вносят вклад преиму­щественно вышеуказанные компоненты эритроцитарных мембран, а также фотосеисибилизированное ими пероксидное окисление ли­пидов.

В 1967 г. Liberman показал, что УФ-излучение (255—285 нм) ингибирует Na⁺, К⁺-АТФазнук> активность нервных волокон кра­ба. Видимый свет ингибировал Na⁺, К⁺-АТФазу различных типов клеток, сенсибилизируемых метиленовым синим, бенгальским розовым или протопорфирином, благодаря фотодинамическому эффекту. Однако чувствительность Na¹', К'-АТФазы к видимому свету в отсутствие экзогенных фотосенсибилизаторов не показа­на. Воздействие излучения аргонового лазера (488 нм, 0,1 Вт/см²) индуцировало ингибирование Na⁺, К⁺-АТФазы из мозга крыс до­зозависимым образом.

В состав а- (более гидрофобна) и ]3-субъединиц молекул этого белка входят некоторые фосфолипиды, среди которых преобла­дают фосфатидилэтаноламин, фосфатидилхолин, сфингомиелин. Вероятно, модификация липидного бислоя при облучении мемб­ран затрагивает конформационное состояние не только погра­ничных (аннулярных) липидов АТФазы, но и непосредственно фосфолипидных компонентов ее а-субъединицы, что приводит к изменению структуры активного центра фермента и нарушению его функциональных свойств.

При изучении УФ-индуцированных изменений ферментатив­ной активности Na⁺, К⁺-АТФазы эритроцитарных мембран, мо­дифицированных фосфолипазой D, было установлено, что пред­варительная обработка мембран фосфолипазой (1О'^Й моль/л, pH 5,6; 0,3 моль/л СаС1₂) приводит к увеличению уровня этого параметра на 33 % по сравнению с контрольным образцом (100 %).

На рис. 48 показаны УФ-индуцированные изменения функ­циональной активности Na⁺, К⁺-АТФазы эритроцитарных мем­бран, обработанных фосфолипазой D. После модификации фос­фолипидов мембраны фоточувствительность связанного фермен­та существенно изменяется. Воздействие УФ-света на обрабо­танные фосфолипазой мембраны приводит к нарушениям в фун­кционировании Na⁺, К⁺-АТФазы, отличающимся по направлен­ности от таковых при облучении интактных мембран, т. е. про­исходит фотоактивация модифицированного фермента. Следо­вательно, обработка липидной фазы фосфолипазой нивелирует протекание процессов, обусловливающих фотоинактивацию Na⁺,

К⁺-АТФазы в УФ-облученных интактных мембранах, и повы­шает фотостабильность фермента.

Изменения в функционировании мембраносвязанной Na⁺, К⁺-АТФазы в УФ-облученных мембранах, предварительно моди­фицированных фосфолипазой D, являются, по-видимому, резуль­татом изменения конформационного состояния аннулярных ли­пидов, нарушения белок-липидных взаимодействий, ответствен­ных за проявление каталитической активности фермента.

Обобщая результаты вышеописанных исследований по изу­чению УФ-индуцированных изменений функциональной актив­ности Na⁺, К⁺-АТФазы и АХЭ эритроцитарных мембран, обрабо­танных фосфолипазой D, можно заключить, что в присутствии последней проявляется различная фоточувствительность этих фер­ментов, обусловленная нарушениями их нативной конформации вследствие модификации белок-липидных взаимодействий, а так­же влияния фотохимических продуктов молекул мембранных фосфолипидов.

Такие различия в “ответной реакции” двух мембранных бел­ков на воздействие физико-химических факторов (УФ-излуче- ние, действие фосфолипаз) связаны с различиями в их локализа­ции на мембране, в расположении их активных центров, в харак­тере взаимодействия с “ближайшими” липидными молекулами и их химическим строением. Однако экспериментальные дан­ные, касающиеся возможности модуляции фоточувствительнос­ти мембранных ферментов, — Na⁺, К⁺-АТФазы и ацетилхолинэс­теразы, возможно, взаиморегулируемых субстратами их реакций, свидетельствуют в пользу представлений об общности основных регуляторных механизмов функционирования для многих век­торных ферментов биомембран.

4.3.