Функциональная активность мембраносвязапной ацетилхолинэстеразы после УФ-облучения в присутствии бензилового спирта и конканавалина А

Значительный вклад в решение проблемы, касающейся изу­чения структурного состояния, локализации, особенностей функ­ционирования отдельных компонентов в составе надмолекуляр­ного комплекса, характера их взаимодействия с ближайшим молекулярным окружением, могут внести методические подхо­ды, связанные с модификацией тех или иных структурных эле­ментов мембран.

Информативным тестом для оценки нативного состояния эритроцитарной мембраны, а также исследования структурных перестроек и изменений в функционировании ее основных ком­понентов — липидов и белков, индуцированных воздействием целого ряда физико-химических агентов, является определение функциональной активности конформационного маркера мемб­раны — ацетилхолинэстеразы (см. раздел 1.2.5).

На рис. 32 показаны изменения функциональной активности мембраносвязанной АХЭ после облучения мембран эритроцитов человека УФ-светом в интервалах длин волн 240—390 нм и 300— 400 нм. Видно, что при воздействии УФ-излучения (240—390 нм)

Рис. 32. Функциональная ак­тивность ацетилхолинэстеразы мембран эритроцитов человека, модифицированных воздействи­ем УФ-излучения: 1 — контроль; 2 — УФ-облучение в интервале длин волн 300—400 нм; 3 — УФ-облучение в интервале длин волн 240—390 нм. Каталитиче­скую активность регистрировали по методу Хестрина, основанному на колориметрическом определе­нии концентрации ацетилхолина

на суспензию эритроцитарных мембран активность исследуемо­го фермента статистически достоверно возрастает на 12 %.

УФ-излучение в интервале длин волн 240—390 нм эффективно поглощается такими структурными компонентами эритроцитарной мембраны, как полиненасыщенные жирные кислоты фосфолипидов, а также ароматические и серосодержащие остатки интегральных белков. Необходимо отметить, что мембранные эффекты УФ-облу­чения в значительной степени вызываются пероксидным окисле­нием липидов и лишь частично обусловлены фотохимическими превращениями белков. Следовательно, поглощение УФ-излучения в интервале длин волн 240—390 нм указанными выше хромофора­ми эритроцитарных мембран индуцирует такие структурные пере­стройки липидного бислоя и интегральных белков, которые, в свою очередь, затрагивают конформационное состояние АХЭ и приводят к увеличению ее функциональной активности.

И. Д. Болотовским и соавт. (1978), С. В. Коневым и И. Д. Бо­лотовским (1979) при изучении влияния структурного состоя­ния липидной фазы мембран эритроцитов на эффективность фо­

тохимической модификации АХЭ, связанной с мембраной, обра­ботанной фосфолипазами, а также обедненной холестерином, сде­лано заключение о важной нефотохимической роли липидной фазы мембран в определении характера и эффективности дей­ствия УФ-света на активность фермента.

Учитывая эти данные, можно констатировать, что ПФОЛ, индуцированное УФ-излучением в интервале длин волн 240— 390 нм, не приводит к фотодеструкции мембранной АХЭ, а по­средством изменения контролирующих конформацию фермента белок-белковых и белок-липидных взаимодействий способствует более эффективному протеканию каталитической реакции. На наш взгляд, интересным представляется тот факт, что облучение мембран эритроцитов длинноволновым УФ-светом индуцирует резкое снижение каталитической активности АХЭ.

На рис. 33 представлены результаты исследования фермента­тивной активности мембранной АХЭ в присутствии конканава- лина А из канавалии мечевидной (Concanavalia ensiformis) в концентрациях 0,4 и 0,8 моль/л. Конканавалин А относится к классу лектинов, связывание которых с поверхностью плазмати­ческой мембраны клеток имеет самые разнообразные последствия, например, вызывает изменение в расположении поверхностных белков и гликопротеинов, физическом состоянии липидов мемб­ран, проницаемости их для различных веществ и активности мем­бранных ферментов (см. раздел 1.3). Конканавалин А, избира­тельно модифицируя структурно-функциональное состояние ин­тегральных мембранных белков, способен изменять и фоточув­ствительность АХЭ.

Рис. 33. Каталитическая актив­носте ацетилхолинэстеразы мемб­ран эритроцитов человека в при­сутствии конканавалина: 1 — кон­троль; 2 — конканавалин в кон­центрации 0,4 моль/л, соотноше­ние суспензии мембран и конка- навалина 1:0,05; 3 — конканава­лин в концентрации 0,4 моль/л, со­отношение 1:0,2; 4 — конканава­лин в концентрации 0,4 моль/л, со­отношение 1:1; 5 — конканавалин в концентрации 0,8 моль/л, соот­ношение 1:1

Из рис, 33 видно, что обработка мембран эритроцитов ука­занным модифицирующим агентом: вызывает снижение функ­циональной активности фермента.

Основные структурные особенности биологической мембра­ны и, следовательно, ее функциональная динамичность опреде­ляются свойствами липидного бислоя, существенно влияющего на подвижность белковых молекул и их ассоциацию в мембране.

Известно, что бензиловый спирт, взаимодействуя преиму­щественно с гидрофобными участками липидной фазы, увеличи­вает подвижность последней, а также изменяет подвижность ее отдельных компонентов.

На рис. 34 показаны изменения функциональной активности мембраносвязанной АХЭ в присутствии бензилового спирта. Ин­кубирование суспензии мембран с этим модификатором приво­дит к снижению каталитической активности исследуемого фер­мента на 16—18 % по сравнению с контролем. Увеличение объе­ма добавляемого спирта до 1 мл не вызывает усиления его инги­бирующего действия по отношению к активности молекул АХЭ. Таким образом, увеличение подвижности липидной фазы с по­мощью бензилового спирта и, тем самым, модификация ближай­шего окружения мембраносвязанной АХЭ — фосфатидилсерина индуцирует снижение ее ферментативной активности.

На рис. 35 представлены данные, полученные при исследова­нии функциональной активности АХЭ мембран эритроцитов, УФ- облученных в интервале длин волн 300—400 нм в присутствии конканавалина А. УФ-облучение интактных мембран эритроци­тов индуцирует снижение каталитической активности АХЭ на 50 %, обусловленное, по всей вероятности, поглощением энергии УФ-света пиридиннуклеотидами, флавинами, железопорфири- нами, витаминами, входящими в состав мембраны.

Рис. 34. Функциональная актив­ность ацетилхолинэстеразы мембран эритроцитов человека, модифициро­ванных 2 %-ным раствором бензи­лового спирта: 1 — контроль; 2 — соотношение суспензии мембран и бензилового спирта 1:0,05; 3 — со­отношение этих компонентов 1:0,2; 4 — соотношение 1:1

Рис. 35. Ферментативная актив­ность ацетилхолинэстеразы мембран эритроцитов человека, облученных УФ-светом в области 300—400 нм в присутствии конканавалина А: 1 — контроль; 2 — активность УФ- облученной АХЭ; 3 — активность АХЭ в присутствии конканавалина; '4 —активность УФ-облученной АХЭ в присутствии конканавалина

На рис. 36 показаны изменения ферментативной активности АХЭ, модифицированной воздействием УФ-излучения (300— 400 нм) в присутствии бензилового спирта. Из анализа рисунка следует, что облучение суспензии эритроцитарных мембран в при­сутствии указанного химического агента индуцирует резкое воз­растание каталитической активности белка: 210 % по сравне­нию с ее уровнем при УФ-облучении интактных мембран (50 %).

Наблюдаемый эффект активации мембранной АХЭ может быть связан, по всей вероятности, со структурными перестройками мо­лекул ближайшего липидного окружения фермента, обусловлен­ными воздействием на него бензилового спирта и, прежде всего, его фотохимических продуктов.

При УФ-облучении мембран в диапазоне длин волн 240— 390 нм в присутствии указанных экзогенных модификаторов на­блюдаются противоположные по направлению изменения функ­ционирования АХЭ.

На рис. 37 представлены результаты исследования катали­тической активности мембраносвязанной АХЭ при воздействии УФ-излучения (240—390 нм) на суспензию мембран эритроци­тов в присутствии конканавалина А (фитогемагглютинина). Из

Рис. 36. Каталитическая актив­ность ацетилхолинэстеразы мембран эритроцитов человека, облученных УФ-светом в области 300—400 нм в присутствии 2 % -ного бензилово­го спирта: 1 — контроль; 2 — ак­тивность УФ-облученной АХЭ; 3 — активность АХЭ в присутствии бен­зилового спирта; 4 —- активность УФ-облученной АХЭ в присутствии бензилового спирта

Рис. 37. Функциональная ак­тивность ацетилхолинэстеразы мембран эритроцитов человека, об­лученных УФ-светом в области 240—390 нм в присутствии кон­канавалина: 1 — контроль; 2 — активность УФ-облученной АХЭ; 3 — активность АХЭ в присут­ствии конканавалина; 4 — актив­ность УФ-облученной АХЭ в при­сутствии конканавалина

анализа рисунка вытекает, что УФ-облучение мембран эритроци­тов в его присутствии индуцирует значительное снижение ак­тивности этого фермента до 12 % (против 112 % при облучении интактных мембран). Вероятно, ингибирование мембраносвязан­ной АХЭ в данном случае происходит за счет конформационных изменений молекул фермента, обусловленных воздействием на последние, а также на молекулы интегральных белков продуктов фотолиза конканавалина и приводящих, по-видимому, к стери- ческому экранированию активного центра. Необходимо отметить, что УФ-облучение буферного раствора (pH 7,6) конканавалина А вызывает статистически достоверное снижение величины опти­ческой плотности в максимуме поглощения при 280 нм, связан­ное либо с разрушением части хромофоров УФ-света лектина — ароматических аминокислотных остатков, либо с их экранирова-

Рис. 38. Ферментативная ак­тивность ацетилхолинэстеразы мембран эритроцитов человека, облученных УФ-светом в облас­ти 240—390 нм в присутствии 2%-ного бензилового спирта: 1 — контроль; 2 — активность УФ-облученной АХЭ; 3 — актив­ность АХЭ в присутствии бензи­лового спирта; 4 — активность УФ-облученной АХЭ в присут­ствии бензилового спирта»

нием на поверхности белковой глобулы. Однако не исключена вероятность и прямого воздействия УФ-излучения на АХЭ.

При УФ-облучении (240—390 нм) эритроцитарных мембран в присутствии бензилового спирта обнаруживается практически полное ингибирование мембранной АХЭ (рис. 38). По-видимому, наблюдаемый эффект может быть обусловлен реализацией не­скольких параллельно протекающих процессов, индуцированных воздействием УФ-излучения на эритроцитарные мембраны и при­водящих к экранированию активного центра:

1) возможная интенсификация ПФОЛ вследствие увеличе­ния подвижности липидной фазы мембран под влиянием бензи­лового спирта, образование продуктов ПФОЛ, влияющих на кон­формацию АХЭ и ее активного центра непосредственно или опос­редованно через взаимодействие с интегральными белками;

2) фотопревращения интегральных белков мембраны, погло­щающих свет в данной области спектра, в том числе и самого фермента (однако в незначительной степени);

3) поглощение квантов УФ-излучения с длинами волн 330— 370 нм пиридиннуклеотидами, флавинами, коферментами, же- лезопорфиринами; фотосенсибилизация ими процессов ПФОЛ; непосредственное влияние их фотохимических продуктов на структурное состояние АХЭ и ее активного центра.

Таким образом, путем модификации отдельных структурных компонентов эритроцитарных мембран различными химически-

ми агентами и выбора условий их УФ-облучения в зависимости от природы и содержания хромофорных групп можно существен­но изменять фоточувствительность мембранных белков, в том числе АХЭ.

4.2.1.