ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА ЛАКТАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ В КОМПЛЕКСЕ С ЭРИТРОЦИТАРНЫМИ МЕМБРАНАМИ И ИХ КОМПОНЕНТАМИ В ИНТАКТНОМ СОСТОЯНИИ И ПОСЛЕ УФ-ОБЛУЧЕНИЯ

В настоящее время считается общепризнанным, что “классическое” исследование ферментов in vitro без учета их вза­имодействия с различными субклеточными структурами не мо­жет дать адекватного представления о закономерностях и меха­низмах их функционирования в составе целой клетки.

L-лактатдегидрогеназа (Ь-лактат:ЫАВ^|'-оксидоредуктаза, КФ 1,1.1.27) — гликолитический фермент, относящийся к клас­су оксидоредуктаз. Он катализирует обратимое окисление L-лактата до пирувата с использованием в качестве кофермен­та NAD⁺.

Лактатдегидрогеназа (ЛДГ) принадлежит к наиболее интен­сивно изучаемым белкам, так как она является ключевым фер­ментом, функционирующим на «развилке» путей аэробного и анаэробного превращения углеводов в тканях.

Молекула ЛДГ представляет собой тетрамер, состоящий из субъединиц двух типов — Н и М (от англ, heart — сердце и muscle — мышца). Молекулярные массы тетрамера и каждой субъединицы составляют 140 и 35 кДа соответственно. Рекомби­нация двух типов субъединиц дает различные изоформы фер­мента: гомотетрамеры Н₄ и М₄ и гибридные тетрамеры (гетеро­тетрамеры) Н₃М, Н₂М₂ и НМ₅. Это количество изоферментов обус­ловлено наличием двух генетических локусов, которые кодиру­ют синтез субъединиц М и Н .

Субъединица М синтезируется главным образом в тканях с анаэробным метаболизмом, в то время как субъединица И присут­ствует в тканях с преобладанием аэробных процессов. В цитозоле герминативных клеток, в частности в сперматозоидах, присутству­ет ЛДГ-Х, составляющая 80 % активности ЛДГ. Показано, что ЛДГ-Х также является тетрамером и состоит из субъединиц ЛДГ-Х, которые по аминокислотному составу отличаются от Н и М.

Изоферментам ЛДГ присущи разные кинетические характе­ристики, величины pH, при которых они проявляют максималь­ную активность, сродство к субстратам и кофакторам. Для опре­деления относительного содержания изоферментов используют ряд физико-химических методов: электрофорез, ионообменную хроматографию, различия в кинетических параметрах отдель­ных изоферментов, дифференцированную чувствительность к суб­стратам и ингибиторам, иммунохимические методы.

Полипептидная цепь обеих субъединиц содержит 330 амино­кислотных остатков; различия в их последовательности в субъе­диницах обнаружены на протяжении более чем 25 % длины по­липептидной цепи.

В субъединицах фермента выделяют два домена: каталити­ческий и центр связывания кофермента. Аминокислоты, образу­ющие ЫАГГ-связывающий домен, расположены в середине моле­кулы ЛДГ. Структура названного домена состоит из шести склад­чатых слоев (ЗА—pF), соединенных между собой ос-спиралями.

Лактатдегидрогеназа связывает лактат или пируват только в присутствии кофермента, причем первым связывается кофер­мент. NAD⁺ (NADH) находятся в гидрофобной полости в изогну­той конформации молекулы ЛДГ.

В каталитическом центре ЛДГ находятся полярные группы, участвующие в связывании кофермента и субстратов и катализе: остатки Arg 109, Arg 171, Arg 101, Glu 102, Asn 140, а также существенный остаток His 195, способный играть роль донора- акцептора И¹ в ходе реакции. Кроме того, для проявления активности фермента необходима сульфгидрильная группа, одна на субъединицу.

Оптимум pH для реакции восстановления пирувата в лак­тат — 6,5—7,5, а для обратной реакции — 8,5—9,0. Ингибируют фермент высокие концентрации NAD, фторпируват (необрати­мо), а-меркаптокислоты (конкурентно по отношению к лактату), сульфгидрильные реагенты. В последнем случае ингибирование предотвращается коферментом и снимается цистином и глута­тионом.

Получены сведения о взаимодействии ЛДГ со структурными белками мышц и миофибриллами, субклеточными частицами, искусственными подложками, микросомами и мембранами сар­коплазматического ретикулума.

Установлено, что взаимодействие ЛДГ с F-актином и натив­ным тонким филаментом приводит к уменьшению каталити­ческой активности фермента. При связывании с F-актином про­исходит увеличение значения константы Михаэлиса для NADH и уменьшение максимальной скорости реакции. Для свободной и связанной форм ЛДГ выполняется уравнение Михаэлиса — Мен- тен. Предполагают, что обратимое взаимодействие изофермента М) ЛДГ с F-актином является специфическим и обусловлено об­разованием белок-белкового комплекса.

Исследование кинетических параметров ЛДГ в растворе и в суспензии гомогената субклеточных частиц скелетных мышц цыпленка позволило выявить, что изофермент ЛДГ Н₄ не связы­вается субклеточными частицами, ЛДГ М₂ полностью и ЛДГ Н₂М₂ частично находятся в связанном состоянии. Связывание изо­ферментов М₄ и Н₂М₂ приводит к значительному снижению ве­личины максимальной скорости реакции, а также константы Ми­хаэлиса для пирувата.

При взаимодействии ЛДГ с митохондриальной фракцией и митохондриальным ингибитором из скелетных мышц кролика отмечено снижение активности фермента. Причем зависимость скорости реакции от концентрации субстратов для связанной ЛДГ была негиперболической, а зависимость І/v от 1/[пируват]1/2 или l/[NADH]3/2 была линейной.

Описано связывание ЛДГ М₄ с искусственными подложками, карбоксиметилцеллюлозой и декстрансульфатом. Взаимодействие ЛДГ из мышц свиньи с декстрансульфатом приводит к появле­нию положительной кооперативности по концентрации NADH, не характерной для фермента в растворе.

В. И. Лущак (1991) изучил физико-химические свойства ЛДГ, связанной с микросомальными мембранами из белых мышц ши­поватого ската. Исследование кинетических характеристик для мембраносвязанного и изолированного ферментов показало, что константа Михаэлиса для данных форм (состояний) ЛДГ прак­тически одинакова. В то же время данный показатель для NADH у связанного фермента в 4 раза ниже, чем у изолированного.

Т. В. Есаковой и М. В. Ивановым (1992) показано, что связы­вание ЛДГ с мембранами саркоплазматического ретикулума ве­дет к снижению удельной активности фермента на 60—70 %. Высказано предположение о том, что взаимодействие фермента с мембранами происходит в участках с высоким и низким срод­ством. Добавление NADH, NAD⁺, а также повышение ионной силы раствора вызывает солюбилизацию связанного фермента. Сни­жение активности ЛДГ в связанном состоянии можно объяснить как маскировкой некоторых субъединиц, диффузионными за­труднениями при связывании субстратов, конформационными пе­рестройками молекулы ЛДГ, так и изменениями физико-хими­ческих свойств среды при переходе фермента из раствора в при- мембранный слой.

Взаимодействие мембран эритроцитов с ЛДГ приводит к сни­жению ее каталитической активности. На рис. 49 представлена зависимость ферментативной активности мембраносвязанной ЛДГ от величины pH среды инкубирования.

По-видимому, с увеличением отрицательного заряда молеку­лы белка вероятность образования его комплекса с мембраной уменьшается. Можно предположить, что участки связывания фер­мента на мембране несут отрицательный заряд.

Эти данные коррелируют с результатами исследования

Рис. 49. Зависимость фер­ментативной активности лак­татдегидрогеназы, связанной с мембранами эритроцитов (2-Ю^-8 моль/л, 0,15 мг/мл бел­ка мембран), от величины pH (за 100 % принята активность свободного фермента при тех же значениях pH)

В. И, Лущака (1991, 1992), который изучил влияние pH среды на экстракцию ЛДГ из микросом плавательных мышц шипо­ватого ската и показал, что степень экстрагируемости фермен­та из микросомальных мембран увеличивается при щелочных значениях pH. Т. В. Всаковаи М. В. Иванов (1992) считают, что для взаимодействия ЛДГ из скелетных мышц свиньи с мем­бранами саркоплазматического ретикулума важен отрица­тельный заряд мембраны. Кроме того, на поверхности мембра­ны существует положительный заряд, затрудняющий связы­вание ЛДГ.

Падение активности фермента в связанном состоянии может быть обусловлено следующими причинами (Б. И. Курганов, Н. И. Лобода, 1977; Б. И. Курганов, 1984):

а) стерическим экранированием активных центров при ад­сорбции;

б) изменением конформационного состояния белковой моле­кулы (или преимущественной адсорбцией одной из конформаци­онных форм фермента, находящегося в растворе);

в) изменением микроокружения фермента при переходе из раствора в примембранный слой (концентрации водородных ионов и субстратов в растворе и на поверхности могут различаться вслед­ствие их взаимодействия с подложкой).

Однако убедительных доказательств в пользу какого-либо од­ного из этих предположений не получено.

Таким образом, процесс ассоциации ЛДГ с эритроцитарной мембраной можно регулировать путем варьирования значений pH среды. Следовательно, важную роль в образовании комплек­сов фермента с различными клеточными структурами играют электростатические взаимодействия.

При взаимодействии ЛДГ с тенями эритроцитов, обработанны­ми тритоном Х-100, наблюдалось снижение каталитической ак­тивности ЛДГ, однако степень инактивации фермента была выше, чем в случае его ассоциации с препаратами нативных мембран. Так, связывание ЛДГ с эритроцитарными мембранами и их “три- тоновыми” тенями при pH 7,4 приводило к снижению ее активно­сти на 25 и 82 % соответственно (рис, 50). При pH 9,0 каталити­ческая активность ЛДГ в присутствии нативных и тритоновых теней статистически достоверно не отличалась от таковой для сво­бодного фермента. Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что ЛДГ эффективнее взаимодействует со спектрин-актино-

вой сетью, представляющей основу мембранного каркаса клетки. Можно предположить, что преобладающий вклад в образование комплекса фермента с эритроцитарной мембраной вносит его ассо­циация с элементами цитоскелета, прежде всего актином и спектри- ном. Это соответствует концепции о центральной роли актина как белка-координатора в регуляции обменных процессов в клетке, предложенной Б. Ф. Поглазовым и соавт. (1983).

При взаимодействии эритроцитарной ЛДГ с нативными и мо­дифицированными тритоном Х-100 мембранами эритроцитов ак­тивность связанного фермента снижается при pH 7,4 на 21 и 30 %, а при pH 5,4 — на 35 и 41 % соответственно. Следователь­но, изменения каталитической активности фермента из скелет­ных мышц и эритроцитов в ассоциированном с эритроцитарными мембранами состоянии имеют идентичный характер и указывают на единый механизм ассоциации мембран эритроцитов с ЛДГ из названных источников.

В присутствии восстановленного кофермента в среде инкуби­рования ЛДГ и мембран ее активность статистически достоверно не отличается от таковой для свободного фермента. Итак, получен­ные результаты можно объяснить тем, что NADH, соединяясь с апоферментом, вызывает его конформационные изменения, кото­рые затрудняют адсорбцию- фермента на подложке биологической природы. Эти данные согласуются с результатами ряда работ

(R. L. Melnick, H. 0. Hultin, 1973; Г. Л. Ермаков, 1993; A. Dabrowska et al., 1989), в которых было показано, что NADH способствует де­сорбции фермента, связанного с мышечными волокнами лосося, липосомами и мембранами саркоплазматического ретикулума.

Ингибирование ЛДГ, ассоциированной с субклеточными части­цами, происходит за счет увеличения константы Михаэлиса для пирувата, а не изменения максимальной скорости реакции (A. Dabrowska et al., 1989). Н. П. Сугробовой и соавт. (1983) показа­но, что связывание ЛДГ с F-актином не изменяет характера зави­симости скорости реакции от концентрации субстрата — а-кето- глутарата. В результате взаимодействия ЛДГ с F-актином макси­мальная скорость реакции снижается в 1,9 раза, а константа Миха­элиса увеличивается в 2,5 раза. Другие результаты получены при исследовании ЛДГ, ассоциированной с митохондриальной фракци­ей печени цыпленка (М. L. Sagrista, J. Bosal, 1987). Зависимость каталитической активности связанного фермента от концентрации пирувата отклоняется от гиперболической формы, а при измене­нии концентрации NADH описывается в рамках кинетики Ми­хаэлиса—Ментен.

Считают, что имеющиеся в литературе противоречивые дан­ные по этому вопросу можно объяснить двумя причинами: осо­бенностями природы биологической подложки и природой само­го фермента.

На рис. 51 показаны результаты исследования зависимости скорости ферментативной реакции ЛДГ, связанной с мембрана­ми эритроцитов, от концентрации пирувата натрия при pH 7,4. Кинетические кривые для свободного фермента и комплекса фер­мент—мембрана подчиняются уравнению Михаэлиса—Ментен. Величина константы Михаэлиса для ЛДГ в растворе равна 0,25±0,02 ммоль/л пирувата, а для мембраносвязанной — 0,60±0,04 ммоль/л. Максимальная скорость ферментативной ре­акции при взаимодействии ЛДГ с мембраной эритроцитов сни­жается в 1,2 раза. Значит, ингибирование фермента происходит за счет увеличения в 2,4 раза константы Михаэлиса для пиру­вата натрия.

Суммируя результаты проведенных экспериментов, можно констатировать, что ассоциация ЛДГ с эритроцитарными мемб­ранами и их белковыми компонентами, представляющими собой мембранный каркас клетки, при различных значениях pH среды приводит к снижению каталитической активности фермента, ко-

Рис, 51. Зависимость ско­рости ферментативной реакции лактитдогидрогвназы в свобод­ном состоянии (!) и в комплек­се с эритроцитарными мембра­нами (2) от концентрации пи­рувата натрия

торос происходит за спет увеличения константы Михаэлиса для пирувата натрия. Эффект ингибирования ЛДГ усиливается при сдвиге pH в кислую область, что свидетельствует об электроста­тической природе взаимодействий между ферментом и мембра­ной. Следовательно, процесс образования комплекса ЛДГ с био­логической подложкой можно регулировать путем варьирова­ния концентрации водородных ионов, а также добавления в ре­акционную среду кофермента NADH.

Обратимое взаимодействие белков-ферментов с различными структурными компонентами клетки представляет собой один из эффективных механизмов регуляции каталитической актив­ности компонентов метаболических систем. В соответствии с отим функционирование ферментов в клетке можно рассмат­ривать как совокупность взаимосвязанных процессов перехода их из свободного состояния в связанное, которые регулируются путем воздействия различных физико-химических факторов и сопровождаются изменением функциональных свойств этих фер­ментов, а, следовательно, и изменением жизнедеятельности це­лой клетки.

Па рис. 52, и представлены результаты исследования каталити­ческой активности ЛДГ, УФ-облученной в дозе 1,5 кДж/и‘ и ассоциированной с эритроцитарными мембранами при pH 7,4. Активность фермента в свободном состоянии после его облуче­ния составляет НЗ % по отношению к контрольному образцу.

1 ко

Рис, 52. Активность лактатдегидрогеназы, УФ-облучеиной в дозе 1,5 кДзк/м², в комплексе с эритроцитарными мембранами при pH 7,4 (а), 5,4 (б), 4,5 (в): 1 — активность УФ-облученной ЛДГ; 2 — активность ЛДГ в присутствии эритроцитарных мембран; 3 — активность ЛДГ, УФ-облучспной в дозе 1,5 кДзк/м² и ассоциированной с эритроцитар­ными мембранами

Каталитическая активность УФ-модифицированной ЛДГ, ассо­циированной с эритроцитарными мембранами, статистически до­стоверно уменьшается па 8 % по сравнению с активностью сво­бодного УФ-облученного фермента.

Таким образом, степень инактивации УФ-модифицированной ЛДГ при pH 7,4 в связанном с эритроцитарными мембранами состоянии выше, чем в свободном состоянии (табл. 13).

На рис. 52, б приведены результаты исследования катали­тической активности ЛДГ, модифицированной УФ-излучением и ассоциированной с эритроцитарными мембранами при pH 5,4. Активность фермента в свободном состоянии после его УФ-облу­чения составляет 65 % по отношению к контрольному образцу. Каталитическая активи ость УФ-облученной ЛДГ и ассоцииро­ванной с эритроцитарными мембранами увеличивается на 21 % по сравнению с каталитической активностью УФ-облученного сво­бодного фермента.

Другими словами, степень инактивации ЛДГ, УФ-облученной и связанной с эритроцитарными мембранами, при pH 5,4 ниже, чем при облучении свободного фермента (см. табл. 13).

Таблица 13

Степень инактивации ЛДГ, УФ-облученной при pH 7,4; 5,4; 4,5 в свободном состоянии и в комплексе с эритроцитар­ными мембранами

Примечание. А_наг — каталитическая активность ЛДГ в натив­ном состоянии; А — каталитическая активность УФ-облученной ЛДГ; ДА — разность величин каталитической активности ЛДГ в нативном и УФ-облученном состояниях.

Нарис. 52, в показаны результаты исследования каталитической активности ЛДГ, УФ-облученной и ассоциированной с эритро­цитарными мембранами при pH 4,5. Каталитическая активность УФ-облученной ЛДГ в комплексе с эритроцитарными мембранами при этом значении pH статистически достоверно увеличивается на 12 % по сравнению с активностью свободного УФ-облученного фермента. Степень инактивации ЛДГ, модифицированной УФ-све­том и связанной с эритроцитарными мембранами, оказывается ниже, чем при облучении свободного фермента (см. табл. 13).

Следовательно, степень инактивации ЛДГ, УФ-облученной и ассоциированной с эритроцитарными мембранами, при pH 4,5 и 5,4 уменьшается по сравнению с таковой для УФ-модифициро- ванного свободного фермента при тех же значениях pH.

Можно предположить, что такое изменение функциональной активности ЛДГ, модифицированной воздействием УФ-света и ассоциированной с эритроцитарными мембранами, может быть связано с изменением микроокружения активного центра УФ- облученного фермента при его адсорбции на мембране.

Вероятно, УФ-модификация и ассоциация ЛДГ с эритроци­тарной мембраной при pH 7,4 приводит к стерическому экра­нированию активных центров ЛДГ, а при pH 5,4 и 4,5 создают­ся более оптимальные условия для катализа. Но нельзя исклю­чить и то обстоятельство, что при УФ-облучении и последую­щей иммобилизации фермента на мембране происходит изме­нение участков его локализации на подложке биологической природы.

С целью проверки справедливости высказанных предположе­ний были исследованы флуоресцентные свойства 1-анилинона- фталин-8-сульфоната в комплексе с мембранами эритроцитов и ЛДГ, УФ-облученной при значениях pH 7,4; 5,4 и 4,5.

На рис. 53 представлены результаты исследования значений интенсивности в максимуме флуоресценции АНС (479 нм) в при­сутствии мембран эритроцитов и ЛДГ, модифицированной воз­действием УФ-облучения при pH 7,4; 5,4 и 4,5.

Из анализа рисунка следует, что при взаимодействии эритроцитарных мембран с ЛДГ, облученной УФ-светом при ука­занных значениях pH, не выявляются статистически достовер­ные отличия значений интенсивности флуоресценции зонда в комплексе “мембраны — ЛДГ в нативном состоянии” и в комп­лексе “мембраны — УФ-облученный фермент”.

Полученные данные, вероятно, указывают на то, что при УФ- облучении фермента не происходит модификация тех его участ­ков, которые ответственны за связывание с эритроцитарными мем­бранами.

Рис. S3. Интенсивность флуоресценции зонда 1,8-АНС в комплексе с эритроцитарными мембранами и ЛДГ, модифицированной УФ-излуче­нием, при pH 7,4 (й), 5,4 (