Ферментативный катализ

Исходным источником энергии для жизни на Земле является сол­нечный свет, но он никогда не утилизируется непосредственно без предварительной трансформации энергии квантов света в энергию химических связей.

Белковые катализаторы, т. е. ферменты, ускоряют практически каждый важный внутриклеточный процесс.

Здесь стоит отметить, что проблема функционирования ферментов неотделима от общей проблемы трансформации энергии в биологиче­ских системах.

Что такое катализатор? Согласно учебникам физической химии, катализатор — это вещество, влияющее на скорость химических пре­вращений других веществ и не меняющееся при этом. В биохимии принято называть начальные вещества химического превращения суб­стратами, а конечные — продуктами. Сказанное выше означает, что после каждого акта превращения субстратов в продукт фермент воз­вращается в свое исходное состояние. Исходное и конечное состо­яния молекул фермента не изменяется, в то время как концен­трация молекул субстрата и продукта меняется с каждым оборотом фермента.

Существует огромная литература, касающаяся как эксперимен­тальных, так и теоретических аспектов ферментативного катализа. Я затрону здесь только те из них, которые имеют прямое отношение к главной проблеме этой главы.

Л. Михаалис сформулировал классический подход к описанию процесса трансформации субстрат-продукт под влиянием фермента. В соответствии с этим подходом, молекулы субстрата и фермента прежде всего образуют так называемый комплекс Михаэлиса, в котором превращение субстрата в продукт идет легче, чем в случае свободного субстрата. Схема ферментативной реакции может быть представлена следующим образом:

Здесь к₂ и к_₂ — константы скорости соответствующих ре­

акций.

Здесь У_о — начальная скорость реакции, т. е. скорость образова­ния продукта (d[P]/d£), [Р] — концентрация продукта, [S] — концен­трация субстрата, У_тах — максимальная начальная скорость реакции (при S —► оо), К_м — константа Михаэлиса:

Согласно (4.13) константа Михаэлиса равна концентрации суб­страта, при которой скорость реакции равна половине максимальной:

Зависимость скорости реакции от концентрации субстрата опи­сывается гиперболической кривой (рис. 4.5). Согласно Михаэлису К_м является главной характеристикой ферментативной реакции для дан­ного субстрата при фиксированных значениях температуры, pH и т.д. Широко используемая схема Михаэлиса ферментативного катализа

основана на классической хими­ческой кинетике, развитой в кон­це XIX века для химических ре­акций низкомолекулярных соеди­нений в газовой фазе или раз­бавленных растворах. Все после­дующие теории ферментативного катализа используют, в конечном счете, ту же основу [1,31]. Од­нако, как было сказано выше, химические процессы с участи­ем макро молекулярных соедине­ний (белков) протекают при воз­буждении особых механических степеней свободы. В литературе было независимо предложено два

Рис. 4.5. Зависимость скорости фер­ментативной реакции от концентрации субстрата (по Михаэлису)

очень близких подхода к ферментативному катализу и процессам вну­триклеточной трансформации энергии, учитывающие механические аспекты функционирования ферментов.

Я начну с релаксационной концепции ферментативного катализа. Первое указание на отклонение каталитического акта ферментативной реакции от классической термодинамики и классической кинетики было, по-видимому, высказано в 1971 году [34]. Было показано, что применение основных постулатов Аррениуса и Эйринга к большин­ству ферментативных процессов может привести к бессмысленным значениям активационных параметров. Функционирование фермента больше похоже на работу механической конструкции, чем на обычную каталитическую химическую реакцию. Феноменологическая самосо­гласованная релаксационная теория ферментативного катализа была предложена в 1972 году [35,36]. Принципиальная идея релаксацион­ной концепции заключается не просто в том, что конфирмационная

релаксация субстрат-ферментного комплекса связана с изменением каталитической активности фермента.

Присоединение субстрата к активному центру фермента иниции­рует конформационную релаксацию, действующую как движущая сила, которая толкает химическую систему (молекулы субстра­та, связанные с активным центром фермента) вдоль координаты реакции.

Любое локальное химическое изменение молекулы белка (присо­единение субстрата или ингибитора к активному центру, редокс из­менения металла в простетической группе, ионизация кислотной или основной группы и т.д.) приводит к появлению конформационно не­равновесного состояния. Быстрая колебательная релаксация активного центра и его ближайшего окружения происходит немедленно после ло­кального возмущения, в то время как структура основной белковой гло­булы остается практически неизменной. Молекула становится нерав­новесной. Новое, кинетически доступное состояние фермент-субстрат- ного комплекса соответствует конформационно измененной структуре с продуктом, связанным с активным центром.

Схема ферментативной реакции может быть представлена теперь следующим образом:

Здесь Е' означает конформационно измененную молекулу фермента.

Эта предельно упрощенная схема включает два типа стадий:

1. Быстрые обратимые стадии связывания и отцепления (стадии а и с).

2. Стадии медленной необратимой релаксации (стадии b и d).

Химические превращения S --------------- ► Р — это один из элементарных

актов схемы (4.16). На рис. 4.6 изображена разветвленная схема с на­бором траекторий, ведущих от ES к Е'Р (стадия b в уравнении 4.16).

Для любой сложной глобу­лы фермента имеется множе­ство возможных путей и воз­можных промежуточных не­равновесных состояний фер- мент-субстратного комплек­са. На рис. 4.7 показан про­филь потенциальной энер­гии при движении системы вдоль одного из возможных

Рис. 4.6. Разветвленная схема ферментативной реакции

Рис. 4.7. Профиль потенциальной энер­гии вдоль одного из возможных путей на схеме 4.6

путей от S к Р. Конечно, вероятности реализации различных путей отличаются друг от друга. Каждый элементарный акт на рис. 4.6 начи­нается с образования нового неравновесного состояния системы и его последующей релаксации к следующему состоянию после преодоления соответствующего барьера. Сре­ди огромного числа возможных траекторий только немногие бу­дут непосредственно участвовать во всем процессе релаксации фермент-субстратного комплек­са.

Возможность микроскопического описания этого релаксационно­го процесса, начиная с первых принципов, практически исключена.

Хотя каждый элементарный акт обратим, весь процесс типа Ь (так же как и d) практически необратим. Это вынуждает нас рассматривать эволюцию системы от ES до Е'Р как механическое движение вдоль выделенной степени свободы, которое закончится после достижения равновесного состояния.

Итак, согласно релаксационной концепции, скорость химичес­кого превращения субстрата в продукт определяется, как правило, скоростью конформационной релаксации. Температурная зависимость скорости обусловлена не изменениями числа молекул субстрата, спо­собных преодолевать активационный барьер, а изменениями кон­струкции фермент-субстратного комплекса, которые влияют на путь и, следовательно, на скорость конформационной релаксации. Из при­веденного анализа можно сделать еще один важный вывод: прямой и обратный пути реакции, катализируемые ферментом, могут суще­ственно отличаться. Это означает, что «релаксационная схема» может быть реализована только вне термодинамического равновесия системы субстрат-продукт. Другими словами, если фермент «работает» как меха­ническая машина, то механизмы реакции вблизи термодинамического равновесия и вдали от него должны различаться.

Соответствующие экспериментальные данные и их детальный те­оретический анализ, так же как и соответствующие ссылки, можно найти в цитируемых выше монографиях.

4.6.