ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ НЕКОТОРЫХ АНТИОКСИДАНТНЫХ ФЕРМЕНТОВ КРОВИ[6]

Лабораторная работа № 15

Исследование каталитической активности супероксиддисмутазы в эритроцитах крови доноров

Супероксиддисмутаза (СОД) осуществляет защитную реакцию в отношении супероксидного радикала кислорода, катализируя реакцию дисмутации О₂* с образованием пероксида водорода (см.

Молекула СОД состоит из двух идентичных субъединиц с мо­лекулярной массой 16300 Да, связанных между собой дисуль­фидной связью.

СОД является одним из быстродействующих ферментов: кон­станта скорости реакции ферментативной дисмутации анион-ра­дикалов составляет 2-10° моль^-1-л"¹.

СОД как один из основных ферментов антиоксидантной сис­темы организма участвует не только в регуляции уровня высоко­реакционноспособных супероксидных анион-радикалов, но и кон­тролирует концентрацию продуктов ПОЛ на стадии иницииро­вания цепей окисления.

Активная генерация О₂* при воспалительных процессах со­пряжена с мобилизацией антиоксидантной системы, приводящей к индукции синтеза СОД, При увеличении длительности токси­ческого воздействия кислорода наблюдается истощение системы антиокислительной защиты организма, повышается скорость ре­акций ПОЛ.

Применение лекарственных форм СОД или СОД-активных соединений позволяет снижать концентрацию О₂\ Таким обра­зом, состояние антиоксидантной защиты и, в частности, уровень СОД, отражает компенсаторные возможности организма при раз­личных состояниях, связанных со свободнорадикальной патоло­гией.

Материалы и оборудование: кровь доноров, хлорид натрия, хлороформ, этанол, 0,01 моль/л Na-фосфатный буфер (pH 8,5), этилендиаминтетраацетат натрия (ЭДТА), тетраметилэтилендиа­мин (ТЭМЭД), нитросиний тетразолиевый (НСТ), рибофлавин, калий йодистый, центрифуга MPW-340, центрифужные весы, спектрофотометр СФ-46, кварцевые кюветы для спектрофотомет­ра, стеклянные пипетки, пробирки, фильтровальная бумага.

Ход работы

Метод определения активности СОД основан на ее способно­сти конкурировать с красителем нитросиним тетразолиевым за супероксидные анион-радикалы, образующиеся при генерации их в системе тетраметилэтилендиамин—рибофлавин. В ходе реак­ции НСТ восстанавливается с образованием гидразинтетразолия, характеризующегося максимумом поглощения при 540 нм. В присутствии СОД степень восстановления НСТ уменьшается.

Выделить эритроциты из крови доноров согласно методике, описанной в лабораторной работе №1. 500 мкл эритроцитов ге­молизировать на холоде с равным объемом дистиллированной воды. Для удаления гемоглобина эритроциты обработать 400 мкл хлороформ-этаноловой смеси (3:5), добавить 100 мкл воды и ос­тавить на 30 мин при +4 “С. Гемолизат центрифугировать при 4000 об/мин в течение 10 мин, отобрать 50 мкл супернатанта и смешать с 600 мкл дистиллированной воды.

Реакционная смесь содержит:

1. Фосфатный буфер — 0,5 мл;

2. ТЭМЭД (0,05 моль/л) в 0,2 моль/л ЭДТА — 0,5 мл;

3. НСТ (0,85 ммоль/л) - 0,5 мл;

4. Вода дистиллированная — 2,5 мл;

5. Раствор, содержащий СОД, — 50 мкл;

6. Рибофлавин (0,034 ммоль/л) — 1 мл.

В контрольную пробу раствор фермента не добавлять. Реак­ция инициируется облучением лампой дневного свет (мощность 20 Вт) на расстоянии 20 см в течение 5 мин. Для остановки реакции прилить 0,5 мл раствора K.J (1 %). Оптическую плот­ность зарегистрировать на спектрофотометре СФ-46 при 540 нм. За единицу активности фермента принимают такое его количе­ство, которое обеспечивает ингибирование восстановления нит- росинего тетразолиевого на 50 %. Активность СОД рассчитыва­ют по формуле

А = (К - 0)/К-100 %,

где А — активность фермента в усл. единицах; К — оптическая плотность контрольной пробы; О — оптическая плотность опыт­ной пробы.

Лабораторная работа № 16

Определение активности каталазы в эритроцитах крови человека спектрофотометрическим методом

Каталаза (пероксид водорода: пероксид водорода — оксидоре­дуктаза, 1.11.1.6) разрушает пероксид водорода, образующийся прямым путем при восстановлении кислорода или более слож­ным путем при дисмутации супероксидных радикалов.

Молекулярная масса каталазы из различных источников составляет 225—251 кДа. Молекула каталазы состоит из 4 иден­тичных субъединиц и 4 групп гематина.

Следует отметить, что каталаза проявляет и умеренную пероксидазную активность, т.е. катализирует реакцию окисле­ния органических веществ пероксидом водорода.

Считают, что каталаза всегда присутствует в биосистемах, где происходят процессы клеточного дыхания с участием цитохро­мов, т.е. там, где в результате восстановления кислорода образу­ется пероксид водорода, который весьма токсичен для живой клет­ки и поэтому должен быть удален.

В связи с тем, что каталаза локализуется преимущественно в печени и эритроцитах, целесообразно определять ее активность в сыворотке крови при заболеваниях печени и гемолитических процессах.

Материалы и оборудование: кровь доноров, хлорид натрия, хлороформ, этанол, 0,01 моль/л Na-фосфатный буфер (pH 6,7), этилендиаминтетраацетат натрия (ЭДТА), пероксид водорода, 10 %-ный раствор серной кислоты, центрифуга MPW-340, цент­рифужные весы, спектрофотометр СФ-46, кварцевые кюветы для спектрофотометра, стеклянные пипетки, пробирки, фильтроваль­ная бумага.

Работа включает 3 этапа (а, б, в),

а) Получение эритроцитов

Эритроциты получают из цельной крови человека путем центрифугирования на центрифуге' MPW-340 при 1500 об/мин в течение 15 мин. Сыворотку отбирают с помощью пастеровской пипетки, добавляют к эритроцитам равный объем 0,9 %-ного раствора NaCl и повторно центрифугируют в том же режиме. Эритроциты отмывают таким способом в растворе NaCl 3 раза. Затем 2 мл эритроцитов разводят 0,9 %-ным раствором NaCl в соотношении 1:1000 до значений оптической плотности D=0,7 при 410 нм, что соответствует концентрации 1,5*10⁸ кл/мл.

б) Получение гемолизата эритроцитов, свободного от гемогло­бина

К 0,5 мл эритроцитов добавляют 0,5 мл бидистиллированной воды для нарушения целостности эритроцитарных мембран и ос­тавляют на холоде в течение 15—20 мин.

Гемоглобин осаждают хлороформ-этаноловой смесью (1:5). Для этого к 1 мл гемолизата добавляют 200 мкл хлороформ-этаноло­вой смеси. Затем гемолизат центрифугируют в течение 10 мин при 3000 об/мин. Отбирают супернатант и в нем определяют активность каталазы, предварительно разбавив его бидистилли­рованной водой в соотношении 1:10.

в) Определение функциональной активности каталазы

Принцип метода. Определение активности каталазы основа­но на ее способности высокоэффективно катализировать реак­цию разложения пероксида водорода на воду и кислород.

Реакционная смесь содержит следующие растворы:

1. Фосфатный буфер (0,01 моль/л), pH 6,7 — 0,5 мл.

2. Этилендиаминтетраацетат натрия (ЭДТА) (10"* моль/л) — 0,5 мл.

3. Пероксид водорода (0,015 моль/л) — 2 мл.

4. Исследуемый образец — 0,1 мл.

Для определения активности каталазы в контрольную и опыт­ную пробы, содержащие исследуемый ферментный раствор, до­бавляют фосфатный буфер, пероксид водорода и ЭДТА. Пробир­ки оставляют на 10 мин при комнатной температуре, предвари­тельно остановив реакцию в контрольной пробе добавлением 1 мл 10 %-ного раствора серной кислоты. Такой же объем серной кислоты добавляют в опытную пробу после окончания инкуба­ции. Каталазную активность определяют на спектрофотометре СФ-46 при длине волны 250 нм.

Холостая проба для учета спонтанной реакции разложения пероксида водорода отличается тем, что вместо образца, содержащего каталазу, в нее добавляют такой жб объем фосфатного буфера.

За единицу активности (А) принимают такое количество (в мо­лях) пероксида водорода, которое'разложилось при инкубации в единицу времени:

А ₌ ДР’-Уі,'^сі(моль/миы на 1 мг белка),

D_x ■ V₂ • с₂ • t

где AD — разность оптических плотностей опытной и контрольной проб; D_x — оптическая плотность холостой пробы; V, — общий объем инкубациоипой смеси; V₂ — объем исследуемого образца; е, — концентрация Н₂О₂; с₂ —- концентрация белка в пробе; п — фактор разведения; t — время инкубации.

Лабораторная работа № 17

Исследование функциональной активности глутатионредуктазы эритроцитов

Глутатионредуктаза (NAD(P)H: окисленный глутатион-окси­доредуктаза), фермент класса оксидоредуктаз, катализирующий восстановление окисленного глутатиона;

GSSG + NADPH + Н⁺ -> 2GSH + NADP⁺, где GS — остаток глутатиона; NADPH и NADP⁺ — соответствен­но восстановленные и окисленные формы кофермента никотин- амидадениндинуклеотидфосфата.

Глутатионредуктаза состоит из двух одинаковых субъединиц с молекулярной массой каждой 50—55 тысяч: полость между ними в ходе реакции занимает глутатион. Субъединицы содер­жат по 4 структурных домена, на одном конце которого располо­жен остаток флавииадениндинуклеотида, на другом NAD(P)H-cbh- зывающие участки. Наиболее полно изучено строение глутати­онредуктазы эритроцитов человека, субъединица которой состо­ит из 478 аминокислотных остатков и содержит по 30 % а-спи­ралей и p-структур.

Активность глутатионредуктазы в сыворотке крови повыша­ется при инфаркте миокарда, онкологических заболеваниях и ге­патитах, а в эритроцитах — при наследственной недостаточности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, что позволяет использовать оп­ределение уровня глутатионредуктазы в диагностических целях.

Материалы и оборудование; кровь доноров, хлорид натрия, хлороформ, этанол, 0,067 моль/л Na-фосфатный буфер (pH 6,6), окисленный глутатион, NADPH, центрифуга MPW-340, центри­фужные весы, спектрофотометр СФ-46, кварцевые кюветы для спектрофотометра, стеклянные пипетки, пробирки, фильтроваль­ная бумага.

Ход работы

Получить отмытые эритроциты по методике, описанной в ла­бораторной работе № 1. 0,5 мл эритроцитарной массы гемолизи­ровать с 10 мл 0,067 моль/л фосфатного буфера (pH 6,6) и оста­вить на холоде 15 мин.

С целью осаждения гемоглобина к 1 мл гемолизата добавить 0,2 мл хлороформ-этаноловой смеси (1:5), тщательно переме­шать, выдержать на холоде 5 мин и центрифугировать при 5000 об/мин в течение 10 мин. Супернатант использовать для определения активности глутатионредуктазы.

0,1 мл супернатанта добавить в спектрофотометрическую кю­вету, содержащую 2,9 мл 0,067 моль/л фосфатного буфера (pH 6,6) с 0,027 ммоль/л окисленного глутатиона и 0,02 ммоль/л NADPH. Оптическую плотность раствора измерить при длине волны 340 нм на спектрофотометре СФ-46 сразу после добавления супернатанта и через 5 мин после инкубации реакционной смеси. Активность глутатионредуктазы (А) оассчитывают по Формуле

где— изменение величины оптической плотнос­

ти реакционной смеси за 5 мин; V_np — конечный объем пробы (3 мл); q — фактор разведения эритроцитов; є — молярный коэф­фициент поглощающего соединения (NADPH), равный 6,2-Ю³ л (моль^-1-см^-1); I — длина оптического пути, см; V_cyl]6p — объем до­бавленного супернатанта (0,3 мл); t — время инкубации реакци­онной смеси (5 мин).

Каталитическую активность глутатионредуктазы выражают в мкмолях превращенного NADPH в 1 мин на 1 мл эритроцитов.