ОСНОВНЫЕ МЕТОДЫ ПРИЖИЗНЕННОЙ! МИКРОСКОПИИ ТЕРМИНАЛЬНОГО СОСУДИСТОГО РУСЛА

Значительные успехи, достигнутые в изучении регионарного кровообращения за последние десятилетия в нашей стране и за рубежом, в большой мере связаны с предшествующей разработкой, усовершенствованием и все более широким внедрением в практику научных исследований методик прижизненной микроскопии сосудистого русла.

Хотя в изучении микроваскулярного русла должны тесно переплетаться структурные и функциональные аспекты, физиологические и морфологические подходы к оценке наблюдаемых явлений, предпочтение абсолютным большинством исследователей отдается методам витальной микроскопии.

Известно, что архитектоника сосудов микроциркуляторной системы чрезвычайно подвижна, а изучаемая прижизненно гемодинамика очень изменчива и непостоянна. Многочисленные более или менее совершенные и отработанные морфологические методы могут дать лишь статическую картину происходящих явлений, констатировать лишь одно из возможных состояний микроциркуляции в данный момент. Основная же задача состоит в том, чтобы проследить динамику циркуляции в различных органах живого организма, наблюдать смену гемодинамических и функциональных отношений в системе кровь—ткань, направленных в своей основе на поддержание адекватного гомеостаза всего организма. Лишь благодаря методам биомикроскопии стало возможным изучить функциональные особенности органной микроциркуляции, топографию и взаимоотношения различных микрососудов, прижизненную структуру эндотелиальных клеток, отношения между эритроцитами и плазмой в движущемся потоке крови, изменения формы и размеров различных элементов крови, ее реологические свойства, изменения проницаемости сосудистой стенки и целый ряд других не менее важных вопросов.

Отдавая должное морфологическим методам исследования микроциркуляторного русла, значительный вклад в разработку которых сделан отечественными учеными и прежде всего В.

К настоящему времени витальная микроскопия представляет собой не какой-то единственный, отдельный метод, а целую систему методик, основной задачей которых является получение наиболее разносторонней информации о состоянии регионарной микроциркуляции в нормальных или патологических условиях. Для своего рода систематизации существующих методик биомикроскопии с определенной мерой условности их целесообразно разделить на две основные группы.

C помощью одних возможно наблюдать и оценивать различные количественные показатели функционального состояния регионарной микроциркуляции, изменения размеров и числа функционирующих сосудов, структуру и проницаемость сосудистой стенки, отношения отдельных компонентов сосудистого русла между собой и с тканью органа и другие.

Вторая группа методик преследует своей целью изучение реологических параметров крови, к которым можно отнести качественную характеристику форменных элементов крови и их отношения с плазмой в движущемся потоке, скорость кровотока и давление крови в различных сосудах и некоторые другие показатели.

Заслуживает внимания характеристика основных этапов развития и совершенствования методов прижизненной микроскопии терминального сосудистого русла, методик его прямого визуального наблюдения в историческом аспекте.

Вплоть до середины XIX века ученые спорили, являются ли капилляры пространствами в тканях или имеют собственную стенку. Более 100 лет назад было установлено, что капилляры выстланы эндотелиальными клетками (Stricher, 1865), определено в основном строение их стенки. В последующие годы интерес к исследованию микрососудов слабеет, и лишь к началу XX века, по образному высказыванию Krogh (1927), капилляры были «открыты снова как предмет, достойный изучения».

Вплоть до начала 30-х годов нашего века визуальные прижизненные наблюдения за микроциркуляцией производились в основном на хорошо просвечиваемых и легко доступных исследованию органах и тканях, таких как кожа, конъюнктива глаза, крыло летучей мыши, защечный мешок хомячка, плавательная перепонка, брыжейка кишки лягушки и др.

Существенный вклад в развитие экспериментальной техники биомикроскопии внесли американские ученые Sandison (1924, 1928) и супруги Clark (1938, 1939), которые разработали, усовершенствовали и внедрили метод прозрачной камеры, применимый для длительных наблюдений микроциркуляции в хроническом эксперименте у млекопитающих. Принцип метода заключается в том, что вживляются две тонкие прозрачные пластинки целлулоида, стекла или слюды, между которыми располагается тонкий слой исследуемой ткани, что позволяет вести наблюдение за микроциркуляцией в проходящем свете при большом увеличении. Clark была предложена камера для изучения растущей соединительной ткани, заполняющей вживленную в ухо кролика камеру, и камера для исследования сосудов подкожной клетчатки уха кролика.

В последующем конструкция камеры совершенствовалась и упрощалась (Т. Г. Натадзе, 1957; Г. Б. Плисе, М. Г. Иоганнсен, 1969; Ahern, 1949; Williams, 1967; Branemark, Lindstom, 1963, и др.). Стало возможным вживлять ее в кожную складку спины мышей, в защечный мешок хомячка и вести длительные наблюдения за течением воспалительных процессов, разрастанием и васкуляризацией трансплантированных тканей шеи опухолевым ростом.

Не углубляясь в критическую оценку методики прозрачной камеры, предложенную Clark, можно отметить, что она, как и другие методики витальной микроскопии, основанные на просвечивании (трансиллюминации) изучаемого объекта, имеет свои положительные и отрицательные стороны. В конечном итоге все определяется обоснованием или показаниями к использованию данной методики. И все же, сыграв свою стимулирующую роль в дальнейшей разработке новых методик исследования микроциркуляции, принцип изучения терминального сосудистого русла в проходящем свете выдержал испытание временем и данный метод продолжает широко применяться в современных исследованиях в самых разнообразных модификациях (А. М. Чернух с соавт., 1975).

Однако возможности изучения микроциркуляции в проходящем свете ограничены; как правило, для этой цели используются легко доступные или прозрачные объекты, наиболее распространенными среди которых являются брыжейка тонкой кишки или брыжейка аппендикса крысы. Именно на этих объектах выполнен целый ряд оригинальных работ по витальной микроскопии (Landis, 1930, 1950; 1963; О. П. Храброва, 1969); многие из них стали уже классическими, например работы Zweifach.

По разработанному Zweifach (1961) методу петля тонкой кишки с мезоаппендиксом извлекается после лапаротомии из брюшной полости и свободно укладывается на стеклянное полукольцо, так что брыжейка располагается слегка натянутой над отверстием этого кольца и постоянно орошается теплым (37° С) раствором Рингера. Эта методика позволяет вести биомикроско- пическое изучение сосудов брыжейки в проходящем свете с большим увеличением микроскопа и производить микрофото- и киносъемку.

В настоящее время имеется целый ряд различных модификаций этой методики, направленных прежде всего на создание наиболее адекватных условий для жизнедеятельности брыжейки и кишки, которые извлекаются из брюшной полости на длительное время.

Считаем целесообразным более детально описать методику исследования микроциркуляции в брыжейке аппендикса и тонкой кишки. При изучении терминального сосудистого русла этой зоны крайне важно щадить исследуемый объект и постоянно поддерживать на оптимальном уровне его влажность и температурный режим, так как он длительное время находится вне брюшной полости. Животное (крыса) фиксировалось к специальному станочку с ванночкой, сделанными из органического стекла. В ванночке размещались извлеченные из брюшной полости (после правосторонней лапаротомии) аппендикс, его брыжейка и петля тонкой кишки, которые обкладывались ватными фитильками, а к ним подводилась трубочка, подающая раствор Рингера. Для поддержания оптимальных условий функционирования органов была использована специальная система орошения их физиологическим раствором, подогреваемым до температуры 37° С. Эта система состояла из емкости, в которой содержался раствор, и теплообменника с электрическим подогревом, по змеевику которого он протекал. Температуру вытекающего раствора можно было регулировать нагревом воды в теплообменнике и изменением скорости подачи жидкости.

Микроциркуляция в мезоаппендиксе и брыжейке тонкой кишки изучалась с помощью микроскопа МБИ-3, вмонтированного в микрофотоустановку МФН-3. На предметный столик микроскопа помещался станочек с ванночкой, в которой были размещены указанные выше объекты.

Вполне достаточным оказалось увеличение X 70 (объектив X10, окуляр Х7). Фотографирование микрососудов производилось фотоаппаратом «Зенит-ЗМ», на пленку РФ-3, для повышения ее чувствительности применялся фенидоновый проявитель.

При изучении микроциркуляции целесообразно учитывать следующие показатели: количество и типы функционирующих сосудов и распределение кровотока между ними; характер кровотока в различных сосудах — особенности движения в них форменных элементов и плазмы крови; размеры сосудов и линейную скорость кровотока в них; реактивность терминальных сосудов по их ответу на аппликацию вазоактивных веществ. Диаметр сосудов определялся окулярметрией и эти данные сопоставлялись с результатами измерения диаметра на фотопленке.

Строгое соблюдение наиболее важных моментов (минимальная травма и поддержание адекватных условий функционирования) необходимо и при исследовании микроциркуляции в сосудах головного мозга, о состоянии которой судили по изучению терминального русла мягкой мозговой оболочки.

Объектом для наблюдения в наших исследованиях служила мягкая мозговая оболочка левой затылочной доли крысы. Для доступа к объекту делался небольшой разрез над левой теменной костью, затем производилась трепанация черепа в этой области, после чего твердая мозговая оболочка удалялась и обнаженная таким образом мягкая мозговая оболочка становилась доступной наблюдению. Она постоянно орошалась теплым раствором Рингера (+37°С). Наблюдение за микроциркуляцией велось с помощью микроскопа МБС-2 при увеличении X25 (объектив Х2; окуляр— X 12,5). Микрофотография и обработка негативного материала производилась тем же способом, что и при исследовании брыжейки.

Основные трудности в использовании методов прижизненной микроскопии обусловлены двумя обстоятельствами: во-первых, необходимостью соблюдения наиболее физиологичных условий для изучаемого объекта при самом щадящем оперативном вмешательстве и, во-вторых, отработкой наилучшего освещения органа, которое позволяло бы не только вести наблюдение под большим увеличением, но и регистрировать изменения микроциркуляции с помощью фото- и киносъемки, а также телевизионной техники. Все исследователи стремятся к преодолению этих трудностей и соблюдению указанных условий, однако это далеко не всегда удается. Поэтому экспериментальная техника биомикроскопии постоянно совершенствуется. Так, заслуживает внимания и более детального описания методика исследования микрососудов с использованием различных световодов.

97

4 Заказ № 123

Основы применения в качестве световода кварцевого стержня заложены в работах Knisely и соавт. (1936, 1938, 1947), а в литературу этот метод так и вошел под названием — метод кварцевого стержня (quartz rod method). Благодаря использованию световодов стало возможным в проходящем свете изучать микроциркуляцию некоторых паренхиматозных органов. В тех случаях, когда в качестве проводника света используется кварцевый стержень, один конец его соединяется с источником света, а другой — подводится под ткань органа или погружается в него. В литературе приводятся различные модификации этой методики, когда в хроническом эксперименте в паренхиму печени, селезенки, почки или другого органа вживляется небольшой световод (Branemark, 1963).

История развития световодной техники для витальной микроскопии органов насчитывает не один десяток лет. Достигнув к концу 30-х — началу 40-х годов нашего столетия определенного совершенства, она сохранилась до настоящего времени без существенных изменений, видоизменялись лишь сами световоды (Knisely, 1937, 1938, 1954; Illig, 1961b). Seneviratne (1949) для изучения микроциркуляции в печени применял прямоугольные кварцевые пластинки с косым срезом на одном конце.

Однако кварцевые стержни, используемые в качестве проводников света, имеют ряд недостатков, к числу которых могут быть отнесены: сложность их изготовления и придания нужной конфигурации части световода, обращенной к объекту; необходимость применения мощных источников света, требующих охлаждения; опасность повреждения стержней из-за их большой хрупкости; возможность травмирования острыми краями стержня подлежащих тканей. Все это стимулировало поиски новых типов световодов.

Используя способность прозрачных акриловых пластмасс проводить свет, С. А. Селезнев и Л. Г. Ванюков (1966) разработали и применили в эксперименте световоды из бесцветного метилметакрилата. Последние соединяются с источником света, образуя общий осветительный узел, что значительно облегчает работу. Им несложно придать любую конфигурацию применительно к источнику света или объекту наблюдения. Возможность изготовления световодов со значительным изменением площади сечения позволяет повысить интенсивность проведения света в направлении от источника его к объекту исследования, а это дает возможность пользоваться источником света малой мощности (30—100 Вт).

Нами был предложен световод в виде конусовидного стержня, соединенного с осветителем (рис. 25). В экспериментах он оказался весьма удобным, использование его позволило изучать микроциркуляцию в таком сложном и непрозрачном объекте, как печень (С. А. Селезнев, 1965). Схема опыта с прижизненной микроскопией печени показана на рис. 26.

В связи с быстрыми успехами оптики оказалось возможным применение гибких световодов из стекловолокна. Такие световоды очень удобны в обращении, свободный конец их подвижен и легко может быть подведен к любому участку органа или ткани.

2 3 4

Рис. 25. Схема устройства световода.

1 — конусовидный стержень из метилметакрилата; 2 — кольцо для крепления световода в осветителе; 3 — конденсор; 4 — лампа накаливания; 5 — кожух осветителя.

Размеры даны в мм.

Рис. 26. Схема опыта с прижизненной микроскопией печени при использовании световода из метилметакрилата.

/ — микроскоп МБС-2; 2 — фотоаппарат (малоформатная зеркальная камера);

3 — подопытное животное; 4 — световод; 5 — универсальный штатив; 6 — осветитель; 7 — устройство для орошения объекта наблюдения.

Г. С. Мазуркевич (1969) предложил оригинальную методику прижизненной микроскопии такой трудно доступной и очень интересной области, как гипофиз, приоткрыв тем самым завесу над интимными процессами циркуляции в этом органе. Им разработан и внедрен в экспериментальных исследованиях на крысах новый, менее травматичный, чем существовавшие ранее, доступ к гипофизу для изучения микроциркуляции в его портальных сосудах.

Число работ по изучению микроциркуляции в портальной системе сосудов гипофиза невелико, что объясняется главным образом трудностями оперативного доступа, требующего обнажения не только области гипофизарной ножки, но также передней доли гипофиза и гипоталамуса. Большая травматичность такого вмешательства ведет к высокой послеоперационной смертности животных. Разработанная Г. С. Мазуркевичем методика менее сложна и делает доступными для наблюдения микроциркуляции переднюю долю гипофиза, гипофизарную ножку с портальными сосудами, область срединного возвышения и серый бугор гипоталамуса.

При изучении характера кровотока в гипоталамо-гипофизар- ной области использовался микроскоп МБС-2, а для получения удовлетворительных фотографий применялось дополнительное освещение — осветительное устройство от микрофотоустановки ФМН-3, где источником света служит лампа накаливания мощностью 170 или 400 Вт.

C целью увеличения мощности светового потока пучок света фокусировался на изучаемом объекте с помощью линзы, которая могла передвигаться относительно источника света. Между линзой и осветителем помещались монохроматический и теплозащитный фильтры.

Еще большие возможности и перспективы в прижизненном изучении микрососудистого русла открывает методика контактной микроскопии, которая особенно целесообразна для исследования микроциркуляции в таких оптически «плотных» органах, как печень, почки, селезенка. Обоснования к применению контактных объективов для изучения микроциркуляции приводятся в статье С. А. Селезнева и А. В. Якубенас (1971). Сами по себе контактные объективы предложены Е. М. Брумбергом (1959), они имеют нулевое рабочее расстояние, их фронтальная линза приводится в соприкосновение с поверхностью исследуемого объекта. Освещение осуществляется с помощью опак-иллюминатора через объектив микроскопа/ Фокусировка микроскопа на определенные структуры в рассматриваемом объекте производится перемещением окуляра. При работе контактный объектив вплотную подводят к органу, что позволяет наблюдать микроциркуляцию и фотографировать ее при довольно больших увеличениях.

Применительно к изучению микроциркуляции контактные объективы обладают рядом достоинств: при их использовании исключается необходимость извлечения органа и расположения его вне организма; с их помощью представляется возможность наблюдать не только поверхностно расположенные сосуды, но и микрососуды, находящиеся в глубине органа (глубина просматривания зависит от структуры органа: чем плотнее орган, тем она меньше). Применение контактных объективов, фронтальная линза которых имеет закругленный край, полностью

исключает вероятность повреждения поверхности движущихся органов, а возможность компрессии подлежащих тканей сводится к минимуму, если при наблюдении микроциркуляции достигать только соприкосновения поверхности органа с объективом.

Микроскоп с контактными объективами можно монтировать на штативе микроскопа МБС-2, что позволяет свободно перемещать его в вертикальном и горизонтальном направлениях в ши-, роких диапазонах. Кроме этого, для изучения микроциркуляции методом контактной биомикроскопии можно использовать контактный люминесцентный микроскоп — МЛК-1. C его помощью изучение микроциркуляции может проводиться как в свете видимой люминесценции, возбуждаемой сине-фиолетовой областью спектра (осветитель вмонтирован в микроскоп), так и в обычном свете с использованием различных светофильтров.

В собственных экспериментах для исследования микроциркуляции в различных органах и получения микрофотографий использовали темнопольный контактный объектив с микрофотонасадкой МФН-12. Только с применением контактной микроскопии стало возможным более детальное изучение характера микроциркуляции в печени и почках (С. М. Вашетина, 1972).

Следует приветствовать все возрастающий интерес исследователей к методу люминесцентной или флюоресцентной микроскопии, который предложен Nordmann, Lenz (1934). Благодаря введению в системное кровеносное русло или в сосуды отдельных органов различных витальных красителей или флюоресцентных веществ удается увеличить естественную контрастность путей микроциркуляции, что способствует лучшему обзору, а, главное, фотографированию изучаемых объектов. Кроме того, применение растворов флюорохромов и некоторых красителей оказалось весьма успешным для изучения проницаемости сосудистой стенки (Н. Я. Коваленко, А. М. Чернух, 1971; А. М. Чернух с соавт., 1972).

Можно предположить, что все более широкое использование микрокиносъемки и телевизионной техники готовит этому методу большое будущее в изучении различных аспектов микроциркуляции, процессов проницаемости сосудистой стенки и транскапиллярного обмена веществ.

Наблюдая и качественно оценивая терминальное сосудистое русло методом биомикроскопии в различных условиях, большинство исследователей стремятся при этом получить как можно больше количественных характеристик функционального состояния микроциркуляции. Здесь применимы и элементарный подсчет числа функционирующих сосудов различных подразделений микроциркуляции, и измерение их диаметра. В настоящее время используются различные способы измерения диаметра сосудов: окулярмикрометрия, определение калибра сосуда на фото и кинопленке, применение метода расщепления изображе-

IOl

ния («image-splitting») (П. Н. Александров, А. М. Чернух, 1972; Guest, Bond, 1973). По мнению некоторых исследователей, наиболее точные размеры диаметра сосудов можно получить, измеряя его на фотографиях (Vanecko и др., 1969).

.Существенный интерес представляет разработка новых методов исследования микроциркуляции и их внедрение в клиническую практику. В настоящее время в клинике широко применяются методы биомикроскопии сосудов ногтевого ложа, кожи, конъюнктивы глазного яблока, сетчатки, слизистых оболочек, где микрососуды располагаются близко к поверхности и легко доступны для наблюдения (Г. М. Соловьев, Г. Г. Радзивил, 1973; А. М. Чернух с соавт., 1975; Bloch, 1955; Illig, 1961а, б). Так, изменения микроциркуляции в конъюнктиве глазного яблока могут служить диагностическим, а нередко и прогностическим показателем состояния микроциркуляции в организме вообще (Bloch, 1955).

В принципе, у человека даже в естественных условиях доступны для изучения микроциркуляции многие органы и ткани. Эти возможности расширяются в клинике при оперативных вмешательствах, например, на органах брюшной полости, однако в этом плане имеется известная доля консерватизма. Порой тормозящим моментом является вопрос о надежности стерилизации объектива микроскопа, который, на наш взгляд, является не настолько сложным и неразрешимым, чтобы тормозить дальнейшее развитие методов биомикроскопии у человека. Так, американские исследователи (Vanecko и др., 1969) до и после операции холецистэктомии изучали микроциркуляцию в печени, стерилизуя объектив микроскопа при низкой температуре. Можно полагать, что в ближайшие годы мы будем свидетелями быстрого роста разностороннего применения методов биомикроскопии для изучения микроциркуляции у человека в различных органах.

Итак, критически осмыслив и оценив методы исследования микроциркуляции, можно заключить, что наиболее физиологичным, перспективным, дающим обширную информацию о состоянии микроциркуляторного русла является метод прижизненной микроскопии.

Многообразие существующих методик биомикроскопии (более или менее совершенных) позволяет исследователю в зависимости от поставленных задач и объекта изучения обосновать и использовать любую из этих методик, заранее предвидя ее информативную ценность.

Большое значение при изучении кровообращения приобретают методы, позволяющие с удовлетворительной точностью производить количественную оценку кровотока по нутритивным капиллярам и анастомозам в заданных экспериментальных условиях и в динамике ряда патологических процессов, характеризующихся выраженными циркуляторными нарушениями.