Микробицидное действие АКМ на микобактерии

Течение туберкулезной инфекции определяется в основном состоянием иммунитета, как врожденного, так и приобретенного. Сегодня не вызывает сомнений, что первым и главным препятствием на пути проникновения и распространения в организме человека многих инфекционных микроорганизмов, в том числе и микобактерий туберкулеза, становятся профессиональные фагоциты: моноциты, макрофаги, гранулоциты [142, 214, 435].

Mycobacterium tuberculosis in vitro характеризуются высокой устойчивостью к действию О₂, Н₂О₂ и гипогалоидов. Некоторые штаммы микобактерий сохраняли более 90 % своей жизнеспособности после 6 часов инкубирования в среде с 10 мМ Н₂О₂ [1088]. Анализ устойчивости разных штаммов M. tuberculosis к О₂ и Н₂О₂ выявил большую устойчивость к Н₂О₂ у штаммов, проявляющих высокую вирулентность при инфицировании морских свинок, при этом чувствительность бактерий к Н₂О₂ не зависела от содержания в них каталазы [801]. Не удалось установить взаимосвязь между вирулентностью штаммов M. tuberculosis и устойчивостью бактерий в системах «Н₂О₂ — пероксидаза — Вг~/С1^-» [802]; цитотоксическое действие гранулоцитов в отношении микобактерий также не зависело от наличия миелопероксидазы [832].

Исследования in vitro и in vivo показывают, что активные формы азота — более эффективные цитотоксические агенты в отношении микобактерий, чем активные формы кислорода (О^-, Н₂О₂) [434, 1833]. Инкубация чувствительного лабораторного штамма H37RV и дикого резистентного к изониазиду и рифампицину штаммов M. tuberculosis в атмосфере с NO· (90 частей на 10⁶ объемных частей) в течение 24 часов приводила к гибели 80 % бактерий, после 48 часов инкубации цитотоксичность составляла 100 % [1049]. Токсический эффект экзогенного NO· одинаково проявлялся в отношении как чувствительных, так и устойчивых к лекарствам микобактерий. Как правило, NO-радикалы токсичны не сами по себе, а действуют через образование других более реакционных форм АКМ, таких как пероксинитрит (ONOO^-) или радикалы диоксида азота (NOp.

Как правило, NO· нестабилен в физиологических средах, однако он может взаимодействовать с глутатионом с образованием нитрозоглутатиона (GSNO), который значительно более устойчив. GSNO может транспортироваться из клетки в клетку, сохраняться в клетках и выступать в качестве донора NO-радикалов. Так как в клетках млекопитающих концентрации GSH могут достигать 10 мМ, то GSNO может служить одним из главных либераторов NO^· в организме и вносить определенный вклад в цитотоксическое действие NO^· в отношении внутриклеточных микроорганизмов, в том числе M.

К результатам экспериментальных работ по изучению прямого действия АКМ на бактерии необходимо относиться достаточно осторожно. Дело в том, что микобактерии туберкулеза характеризуются медленной скоростью роста (время удвоения около 20 ч), а время жизни большинства реакционных форм АКМ в физиологических средах ограничено и составляет от 10^-9 с (ОН-радикал) до 2—3 с (пероксинитрит) [147]. Поэтому приходится либо дробно с каким-то интервалом времени вводить короткоживущие АКМ в среду инкубирования [1110], либо, как в случае с NO·, создавать определенную концентрацию этого радикала в атмосфере культивирования [1049]. В исследованиях часто применяются химические доноры NO· или О₂, но не учитывается тот факт, что образование одного радикала требует появления другого радикала (закон сохранения спина в электромагнитных взаимодействиях). Поэтому в зависимости от условий один и тот же донор может выступать источником совершенно разных форм АКМ. В частности, при разложении 3- морфолинозиднонимина, который широко применяется в биологических исследованиях в качестве химического донора NO·, в равных пропорциях образуются NO· и О₂, большая часть которых в нормальных условиях взаимодействует между собой с образованием ONOO^-, однако при наличии в среде супероксиддисмутазы NO· превалирует [74].

Гипогалогениты и органические гидроперекиси достаточно стабильны, однако биологическое действие Н₂О₂ и других перекисей прямо зависит от наличия в среде и клетках ионов металлов переменной валентности как в свободном виде, так и в составе металлопротеинов.

Получение методами генной инженерии трансгенных экспериментальных животных, несущих мутации в генах NADPH-оксидазы или индуцибельной NO-синтазы, позволило создавать новые модели для изучения вклада данных ферментативных систем в защиту организма от патогенных микроорганизмов. Эксперименты, выполненные на нокаутированных по NADPH-оксидазе и индуцибельной NO-синтазе мышах, выявили у таких животных повышенную распространенность очагов поражения и смертность при инфицировании M. tuberculosis [233, 1068]. У мышей с «выключенной» gp91^phox-субъединицей NADPH-оксидазы внутривенное введение M. tuberculosis вызывало быстрое размножение бактерий в легких, в то время как в селезенке и печени развитие инфекции было аналогичным таковому у животных контрольной линии В6 [233]. При воздушно-капельном инфицировании M. tuberculosis (штамм Erdman) с помощью аэрозольного генератора у мышей, нокаутированных по субъединице р47^р110Х NADPH- оксидазы, в период с 14 по 30 день наблюдалось более высокое (приблизительно в 10 раз) содержание бактерий в легких по сравнению с контрольной группой животных с активной NADPH-оксидазой, на 40-й день после инфицирования различия нивелировались [487].

Несмотря на кажущуюся простоту интерпретации результатов, эксперименты на нокаутированных животных не позволяют получить однозначных данных о вкладе той или иной ферментативной системы генерации АКМ в защиту организма от бактериальных инфекций. Это связано с тем, что O₂ и NO· не только выполняют микробицид- ную функцию, но и являются важными внутри- и внеклеточными регуляторами, они контролируют синтез цитокинов, клеточную пролиферацию и апоптоз, а соответственно, в значительной степени определяют развитие воспалительного процесса и персистенцию микобактерий [36, 75]. Туберкулезные гранулемы преимущественно содержат активированные по классическому пути макрофаги, при этом главными цитокинами, контролирующими развитие инфекции, служат ИЛ-12, интерферон-γ и ФНО-α [104, 969]. Продукция активных форм кислорода и азота активированными макрофагами служит эффективным средством контроля персистенции внутриклеточных микроорганизмов, в том числе микобактерий туберкулеза [1217]. Считается, что усиление фагоцитарной активности с одновременным снижением микробицидного потенциала при альтернативной активации макрофагов является причиной перехода латентного хронического туберкулеза в острую форму. Действительно, клинико-лабораторные исследования выявляют у больных туберкулезом повышенную активность Т2-хелперов и, как следствие, высокий уровень циркулирующих в крови ИЛ-4 и ИЛ-13, а также иммуноглобулина Е [1026, 1482]. Нейтрализация ФНО- α приводит к реактивации туберкулезной инфекции [807]. Для ВИЧ-инфицированных людей характерен сдвиг иммунного ответа в сторону Т-хелперов 2 типа и, как следствие, значительное возрастание заболеваемости туберкулезом [104]. Синтез многих хемокинов и цитокинов с возрастом не изменяется, однако значительно снижается продукция интер- ферона-γ, что может служить причиной повышения заболеваемости туберкулезом [1690].

В исследованиях цитотоксического действия активных форм азота, выполненных на клетках животных и человека, наблюдаются значительные различия. Дело в том, что в отличие от фагоцитов мышей и крыс гранулоциты и моноциты крови человека характеризуются низким уровнем продукции NO· [147, 1504], в то же время в макрофагах человека, в том числе альвеолярных из воспалительных очагов, наблюдается достаточно высокая индукция экспрессии NO-синтазы и оксидов азота в ответ на цитокины и бактериальные липополисахариды [1736]. Анализ продукции NO₂ в культурах альвеолярных макрофагов, полученных от 17 здоровых людей, при инфицировании M. tuberculosis выявил высокую гетерогенность экспрессии NO-синтазы и продукции нитрита [1408]: на седьмой день эксперимента концентрация NO₂ в культуральной среде макрофагов от семи доноров составляла 4 ± 0,2 мкМ, тогда как в культурах клеток четырех доноров она достигала значения 502 ± 167 мкМ. Внутриклеточный рост микобактерий в культурах альвеолярных макрофагов с низкой продукцией NO· был достоверно выше по сравнению с клетками, продуцирующими средние и высокие концентрации нитрита. Анализ экспрессии индуцибельной NO-синтазы в клетках альвеолярного лаважа у 11 больных туберкулезом показал, что в среднем 65 % клеток взаимодействовали со специфическими антителами к индуцибельной NO-синтазе, в то время как в лаваже 5 здоровых людей было только 10 % позитивных клеток [1209]. У больных с острой формой туберкулеза легких показано 2,5-кратное увеличение содержания NO· в выдыхаемом воздухе, при этом наблюдалась прямая корреляция между наличием газообразного NO· и экспрессией индуцибельной NO-синтазы в альвеолярных макрофагах, а также спонтанной продукцией NO₂ выделенными клетками [1716].

Анализ заболеваемости туберкулезом у жителей Гонконга с верифицированным диагнозом хронического гранулематоза, при котором фагоцитирующие клетки не способны продуцировать O₂, показал, что в популяции таких людей заболеваемость в десятки раз выше, чем в среднем по региону [977]. В литературе также имеются эпидемиологические данные, косвенно указывающие на важность противотуберкулезного действия активных форм азота и кислорода у людей. Так, в 1991—1994 гг. в Нью-Йорке было отмечено увеличение числа больных туберкулезом; микобактерии (штамм СВ3.3), полученные от данных людей, in vitro обладали высокой устойчивостью к действию активных форм азота [623]. В сельскохозяйственном районе США на границе штатов Кентукки и Теннеси в 1994—1996 гг. была зарегистрированы вспышка весьма агрессивной формы туберкулеза. Выявленный возбудитель — штамм M. tuberculosis CDC1551 — при культивировании in vitro в течение 3 недель был более устойчив к действию H₂O₂ (2,5 мМ) и нитрита натрия (3,6 мМ), чем ряд других штаммов M. tuberculosis (H37Rv, H37Ra, Erdman, RJ2E, C.C.13, C.C.22), а также M. bovis Ravenel и M. bovis BCG [604].

Имеющиеся на сегодняшний день данные о цитотоксическом действии АКМ на микобактерии туберкулеза как in vitro, так и in vivo чрезвычайно противоречивы. Поэтому трудно говорить о каких-то конкретных механизмах цитотоксичности. Все классы биомолекул (белки, липиды, нуклеиновые кислоты) могут повреждаться под действием реакционных форм АКМ [147], в то же время в каждом конкретном случае выявляется свой критический элемент повреждения. Возможно, что в отношении M. tuberculosis, так же как и других внутриклеточных бактерий, цитотоксический эффект NO· связан с нитрозилированием железосерных групп в активных центрах жизненно важных ферментов, включая Fе-СOД. Однако в настоящее время данный вопрос остается абсолютно неисследованным.