Защита микобактерий от токсического действия АКМ
Микобактерии туберкулеза обладают значительной устойчивостью к различным физическим и химическим агентам, холоду, теплу, влаге и свету. В естественных условиях при отсутствии солнечного света они могут сохранять свою жизнеспособность в течение нескольких месяцев, в уличной пыли не погибают на протяжении 10 дней, на страницах книг могут жить до 3 месяцев.
В воде микобактерии сохраняются очень долго (в течение 150 дней). Так как вне клеток и вне организма M. tuberculosis находятся в условиях высокого содержания кислорода, то их длительная жизнеспособность указывает на наличие эффективных механизмов антиоксидантной защиты. Прежде всего это касается ферментативных антиоксидантов: супероксиддисмутаз, каталазы и пероксидаз.Напомним, что описанные для аэробных организмов СОД по строению активного центра делятся на три основных класса: Fe-СОД — эволюционно наиболее древняя изоформа СОД, обнаруживаемая преимущественно у прокариот; чувствительная к цианидам Си,/п-СОД содержится в ядрах цитоплазме и межмембранном пространстве митохондрий клеток эукариот; цианидрезистентная Mn-СОД выявляется в митохондриях и хлоропластах клеток животных и растений, а также многих видов бактерий. Длительное время Си,/п-СОД рассматривалась как фермент, присущий только клеткам эукариот, хотя были известны прокариоты Photobacterium leiognathi, симбионт рыб семейства сребробрюшковых, и Caulobacter crescentus, на ранних стадиях эволюции также бывшая симбионтом, имеющие Си,/п-СОД и получившие изозим в результате естественного горизонтального переноса гена от хозяина. В середине 1990-х гг. в грамотрицательных бактериях был идентифицирован ген sodC, кодирующий Си,/п-СОД. В отличие от клеток эукариот, у которых основная часть фермента находится в цитоплазме и внутриклеточных структурах, в бактериях Си,/п-СОД локализована в периплазме, поэтому предполагается, что главное предназначение бактериальной Си,/п-СОД — защита от цитотоксического действия фагоцитирующих клеток, которое во многом определяется одноэлектронным восстановлением О2 активированной NADPH-оксидазой, а также образованием пероксинитрита при взаимодействии О2 с NO· [147, 1833].
Микобактерии туберкулеза синтезируют две изоформы СОД: Fe-СОД (белок массой 23 кДа, кодируется геном SodA) и Си,/п-СОД (ген SodC), которые служат для защиты от токсического действия фагоцитов [1322]. Выделяемая из M. tuberculosis активная Fe- СОД является тетрамером, анализ аминокислотной последовательности ее субъединиц показал высокое сходство с Мп-СОД из других микроорганизмов, однако в активный центр фермента входили ионы железа [1838]. В культурах микобактерий туберкулеза значительная часть Fe-СОД выявляется вне клеток в среде культивирования [258]. Си,/п- СОД M. tuberculosis — мономерный пептид, содержащий 240 аминокислотных остатков, и только на 25 % сходный с супероксиддисмутазами, кодируемыми геном SodC, из других видов бактерий [1784]. Электронная микроскопия препаратов M. tuberculosis после обработки антителами к C^Zn-СОД, связанными с атомами золота, показывает, что основная часть фермента локализована на периферии бактериальных клеток [1784].
На разных этапах своего роста М. tuberculosis выделяют во внешнюю среду целый ряд белков (идентифицируется более 30 белков с молекулярной массой от 5 до 200 кДа [258]), которые необходимы для их роста и защиты. Многие из данных белков являются ферментами (глутаминсинтетаза, супероксиддисмутаза, фосфолипаза С и др.) и служат для защиты от токсического действия фагоцитов [1386]. В частности, глутаминсинтетаза необходима для синтеза L-глутамат/глутамин-полипептидов, входящих в состав оболочки бактерий, фермент также отвечает за синтез аммиака (NH3), который предотвращает закисление среды в фагосоме и ингибирует слияние фагосом с лизосомами. На стадии экспоненциального роста Fe-СОД и C^Zn-СОД в значительных количествах выявляются в культуральной среде и на поверхности М. tuberculosis. Так, после 16-дневной инкубации бактерий штамма М. tuberculosis H37Rv активность СОД в культуральной среде составляла 1580 ЕД, в то время как в клетках — только 282 ЕД, или всего лишь 15 % от общей активности [1386].
Причины и механизмы внеклеточного экспорта СОД на сегодняшний день не ясны. Посредством внедрения в М. tuberculosis генов СОД из других видов бактерий было показано, что Fe-СОД (M. smegmatis) и Mn-СОД (E. coli), несмотря на их значительное структурное различие, в аналогичной для Fe-СОД М. tuberculosis пропорции выявляются во внутри- и внеклеточной среде [1657]. Проведенный исследователями анализ показал, что ни один из известных для бактерий механизмов активного транспорта белков через мембраны не подходит для описания внеклеточного экспорта СОД микобактериями туберкулеза, из чего было сделано предположение, что внеклеточная СОД появляется в результате аутолиза микобактерий. Значительные различия в количественных оценках содержания внеклеточной СОД (20 % [1657], 76 % [727], 92 % [1386]) объясняются разной устойчивостью фермента в культуральных средах.На сегодняшний день роль отдельных изоформ СОД в защите микобактерий туберкулеза в достаточной степени не выяснена. Методами генной инженерии были получены мутантные по гену sodC штаммы M. tuberculosis H37Rv и M. bovis BCG; при культивировании in vitro устойчивость мутантных штаммов к действию экзогенных О2 и Н2О2 была ниже, чем исходных штаммов, однако выживаемость в культурах мышиных макрофагов из костного мозга и вирулентность на модели морских свинок мутантных и исходных штаммов были одинаковыми [566].
Одним из токсичных элементов фагоцитирующих клеток, и не только фагоцитов, является пероксинитрит. Естественно, возникает вопрос: существуют ли специфичные механизмы защиты от данной формы активного азота у прокариот? Было показано, что пероксидазы, кодируемые геном catG, а также пероксиредоксин-алкилгидропе- роксидредуктазы С (ген ahpC) in vitro проявляют пероксинитритазную и пероксинит- ритредуктазную активности [381, 1745]. Экспрессия генов catG и ahpC в определенной степени коррелировала со скоростью размножения разных штаммов микобактерий, их способностью размножаться в моноцитах человека, а также вирулентностью на моделях внутривенного введения мышам и морским свинкам [1024, 1088].
Сравнительное исследование устойчивости к пероксинитриту диких штаммов M. tuberculosis H37Rv M. smegmatis mc2155, а также мутантных по гену ahpC штаммов выявило прямую взаимосвязь между экспрессией ahpC и устойчивостью к ONOO-, в условиях воздействия NO· (образовывался при разложении DETA-ноноата) достоверных различий в выживаемости данных штаммов не наблюдалось [1110]. В макрофагальных клетках линии J774A после 7 дней инкубирования выживаемость штаммов, экспрессирующих ген ahpC, также была выше. У большинства микобактерий ген ahpC, кодирующий семейство алкилгидропероксидредуктаз, связан с геном oxyR, формируя единую систему ответа на окислительный стресс, возможно, через oxyR-регулон [275].Интерес исследователей к регуляции транскрипции oxyR у M. tuberculosis связан с проблемой развития лекарственной устойчивости к изониазиду. Действительно, по