ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ НЕОРГАНИЧЕСКИХ ПОЛИФОСФАТОВ

(по Р. Лангену, Р. Лиссу, модификация И.С. Кулаева и др.)

В обмене веществ многих низших организмов существенное место за­нимают превращения неорганических полифосфатов, являющихся макро- эргическими соединениями.

Ход анализа

Кислоторастворимая фракция. Навеску исследуемого материала (5-7 г) заливают 10-15 мл 0,5 и. НСЮ4 и фиксируют в криогидратной сме­си. После фиксации навеску с НС1О₄ переносят в фарфоровую ступку, рас­тирают с кварцевым песком до гомогенного состояния и прокачивают на ротаторе 30 минут при пониженной температуре. Полученный гомогенат центрифугируют в течение 5 минут при 3000 об/мин. Экстракт сливают и ставят в холодильник. Осадок заливают 10 мл 0,5 и. НСІО4 и прокачивают еще раз в течение 30 минут при 0^иС, а затем центрифугируют при тех же условиях. Экстракты объединяют в мерной колбе, а осадок трижды про­мывают холодной дистиллированной водой. Промывные воды объединяют с кислотными экстрактами, немедленно нейтрализуют 0,2 и. NaOH по фе­нолфталеину и доводят до определенного объема. Образующиеся хлопья натриевой соли хлорной кислоты удаляют центрифугированием.

Для количественного определения полифосфатов проводят следующие операции. Сначала осуществляют сорбцию нуклеотидов на активирован­ный уголь марки БАУ с размером частиц 0,5-1,0 мм или марки Norit А (Голландия). Перед добавлением угля определяют оптическую плотность экстракта при 260 нм. Сорбцию проводят на холоде при постоянном пере­мешивании в течение 1-2 часов.

ПФ=(Р₇-Р_орто) - (Р₃₀-Р₇),

где величина (Р₇-Р_орто) представляет собой лабильный фосфор фракции.

Содержание стабильного фосфора, который представлен фосфором ор­ганических соединений, находят по разности между общим фосфором и суммой фосфора полифосфатов и ортофосфата:

Рорг ^_ Робщ " (Рпф + Рорто)-

Солерастворимая фракция. После удаления кислоторастворимых со­единений к остатку добавляют 1,5 г перхлората натрия и 1 мл 0,5 и. НСЮ4 и прокачивают на холоде в течение 15 минут. После этого добавляют 15 мл холодной дистиллированной воды и продолжают экстракцию еще 15 ми­нут. Экстракт отделяют центрифугированием при 3000 об/мин, данная процедура повторяется дважды. Затем осадок промывается несколько раз холодной дистиллированной водой. Промывные воды объединяют с экс­трактами и доводят до определенного объема. Солерастворимую фракцию анализируют так же, как и кислоторастворимую.

Фракция фосфолипидов. Остаток после извлечения солерастворимой фракции трижды обрабатывают 96%-ным этанолом на холоде. Затем про­водят многократную экстракцию смесью этанол-серный эфир (3:1) при комнатной температуре до полного извлечения пигментов. Последний раз остаток промывают эфиром и высушивают в вакуум-эксикаторе. Все спир­товые и спирт-эфирные экстракты объединяют в мерной колбе и доводят до метки.

К общ -^липидов-

Щелочерастворимая фракция, pH 8-9. К остатку после удаления липи­дов добавляют несколько миллилитров холодной дистиллированной воды и с помощью 0,2 и. NaOH доводят pH раствора до 8-9 при 0°С. Экстракцию проводят в течение 40 минут при постоянном перемешивании. Затем экс­тракт отделяют центрифугированием. К остатку добавляют небольшое ко­личество холодной дистиллированной воды и оставляют еще на 40 минут. Экстракт вновь отделяют центрифугированием. Остаток тщательно про­мывают холодной водой. Оба экстракта объединяют с промывными вода­ми и доводят до определенного объема. Во фракции определяют: 1) орто­фосфат (Рорто); 2) фосфор соединений, гидролизующихся до ортофосфата в течение 7 минут; 3) общий фосфор. Количество полифосфатов рассчиты­вают по величине лабильного фосфора фракции:

Рпф ^_ Р7 " Рорто-

Органический фосфор определяют по разнице:

Рорг ^_ Робщ " (Рпф + Рорто)-

Щелочерастворимая фракция, pH 12. Эту фракцию экстрагируют 0,05 н. NaOH (рН=12) при 0°С и тщательном перемешивании в течение 2 часов. Экстракт отделяют центрифугированием, а остаток несколько раз промы­вают холодной дистиллированой водой. Промывные воды объединяют с экстрактом и доводят до определённого объёма. Фракцию анализируют так же, как и предыдущую.

Фракция, экстрагируемая НСЮ₄при 90-100°С. Остаток после удаления щелочерастворимых фракций обрабатывают 0,5 н. НСЮ4 на водяной бане при 90-100°С последовательно в течение 20 и 10 минут. Остаток после центрифугирования тщательно промывают холодной дистиллированной водой. Экстракты объединяют с промывными водами и доводят до опреде­ленного объема. В объединенном экстаркте определяют: 1) ортофосфат;

2) общий фосфор. Считается, что ортофосфат этой фракции образуется в основном в результате гидролиза неорганических полифосфатов.

Органический фосфор рассчитывают по формуле:

Рорг ^— Робщ " Рорто-

Фракция фосфопротеинов. После всех экстракций остаток сжигают с концентрированной H₂SO₄ и НСЮ₄ и определяют общий фосфор. По об­щему фосфору судят о содержании фосфопротеинов:

г общ -Г фосфопротеинов-

Таким образом, данный метод позволяет учитывать пять различных фракций полифосфатов: кислоторастворимые, солерастворимые, щелоче­растворимые при pH 8-9, щелочерастворимые при pH 12 и полифосфаты, экстрагируемые НС1О₄ при 90-100°С. Кроме того, эта методика дает воз­можность судить о характере накопления фосфора в некоторых органиче­ских соединениях. Так, органический фосфор кислоторастворимой (после сорбции нуклеотидов) и солерастворимой фракций представлен в основ­ном фосфором углеводов. Следовательно, органический фосфор обеих фракций может отражать характер накопления фосфоуглеводов. О фосфо­ре липидов можно судить по фосфору фракции, извлекаемой смесью эта­нол-эфир. Органический фосфор щелочерастворимых фракций и фракции горячего кислотного экстракта содержит до 95% фосфора нуклеиновых ки­слот. Поэтому органический фосфор этих трех фракций позволяет судить о характере накопления нуклеиновых кислот. Остаток при данных условиях фракционирования содержит в основном фосфопротеины, следовательно, величина остатка фосфора может характеризовать накопление фосфопро- теинов.

При количественном учёте неорганических полифосфатов определение фосфора можно проводить по методу Пануша и др [2]. При использовании этого метода может происходить некоторый гидролиз кислотолабильных соединений, но зато он прост и быстр.

Ход определения

К 2,75 мл раствора, содержащего от 20 до 200 нМ фосфата, добавляют 1,25 мл ацетатного буфера pH (9 г уксуснокислого натрия и 0,5 мл серно­кислой меди доводят до 100 мл 4 н уксусной кислотой ), 0,5 мл раствора молибдата (5%-ный раствор молибдата аммония в воде) и 0,5 мл метельно­го реактива (0,2%-ный раствор метола в 5%-ном растворе сульфата на­трия).

Для определения Р₇ и Р_зо к 1 мл пробы добавляют 1 мл 2 н. НС1. Рас­твор гидролизуют 7 и 30 минут соответственно при 100°С, после чего бы­стро охлаждают и проводят определение фосфора, как описано выше.

Для определения общего фосфора к части пробы добавляется 0,5 мл концентрированной НСЮ4 и 10 мл H2SO4. После упаривания при 120°С проба сжигается при 200°С до полного обесцвечивания. Нейтрализованную после сжигания пробу доводят до определенного объема и определяют ортофосфат.

Литература

1. Окунцов М.М., Боровик З.И., Гребенников А.С. и др. Специальный практи­кум по биохимии и физиологии растений. Калининград, 1981. С. 23-26.

2. Pcinusz Н.Т., Graczyk G., Wilmanska D., Skarzynsky I. Analysis of orthophos­phate-pyrophosphate, mixtures resulting prom weak, pyrophosphatase activities. // Analyt. Biochem. 35(2). 1970. 494-504.