КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЛИПИДНОГО СОСТАВА ЭРИТРОЦИТОВ

При изучении биомембран обычно имеют дело с относитель­но небольшими количествами липидов, поэтому для их разделе­ния чаще всего используют метод тонкослойной хроматографии (ТСХ) на силикагеле, позволяющий проводить и качественный, и количественный анализ липидов различных классов.

Для лучшего разделения липидов рекомендуют активировать хроматографические пластинки, прогрев их при 110 °С в тече­ние 30 мин. Исследуемые образцы в полярном растворителе на­носят на расстоянии около 2,5 см от края пластинки в виде по­лос или пятен при помощи микропипетки с тонким наконечни­ком. Прежде чем начинать разделение, необходимо убедиться, что растворитель полностью испарился из нанесенных образцов. Уровень растворителя в камере должен быть примерно на 1 см ниже уровня нанесенных образцов.

При разделении смеси липидов сложного состава проводят двумерную хроматографию с использованием двух систем раст­ворителей. Для этого образец наносят в одном углу пластинки и проводят разделение в первой системе растворителей, причем пятна липидов располагаются вдоль одного края пластинки. Ее высушивают, поворачивают на 90“ (пятна должны располагаться внизу) и проводят разделение во второй системе растворителей. Все классы липидов нельзя разделить в одной системе раствори­телей. Поэтому выбирают систему растворителей для разделе­ния определенного класса липидов. В случае полного анализа липидов используют несколько систем растворителей.

Лабораторная работа № 14

Определение фосфолипидов эритроцитарных мембран методом тонкослойной хроматографии

Материалы и оборудование: хлороформ, метанол, бензол, си­ликагель КСК или 1-І, стеклянные пластинки 6x6 см (9x12 см), активированный гипс (или карбонат натрия). 25 %-ный водный раствор аммиака, ацетон, ледяная уксусная кислота, серная кис­лота, бутанол, нингидрин, раствор Драгендорфа, 42%-ная хлор­ная кислота, молибдат аммония, аскорбиновая кислота, кровь доноров, стеклянные пробирки, пипетки, центрифуга, роторный испаритель, хроматографическая камера, шаровая мельница, во­дяная баня, фотоэлектроколориметр КФК-3.

Ход работы

Получить хорошо отмытые эритроциты по методике, описан­ной в лабораторной работе №1.5 мл отмытых эритроцитов обра­ботать 15 мл смеси хлороформ-метанол (1:2). Смесь перемешать стеклянной палочкой и оставить в холодильнике на 10—12 ч, затем отцентрифугировать при 5000 об/мин и отделить супер­натант и поместить его в холодильник. Осадок реэкстрагировать 19 мл смеси хлороформ—метанол—вода (1:2:0,8) и снова цент­рифугировать при тех же условиях. Супернатанты, полученные в результате двух экстракций, разбавить 10 мл хлороформа и 10 мл воды, В результате образуется двухфазная система, ниж­ний слой которой состоит из хлороформа с растворенными в нем липидами, свободными от загрязнений, а верхний — из смеси метанола и воды, содержащий водорастворимые нелипидные при­меси. Отделить хлороформную фракцию, разбавить ее равным

17.

257

по объему количеством бензола и упарить на роторном испари­теле или под тягой на водяной бане при 40—50 ’С. Липиды взве­сить и растворить в нужном объеме хлороформа для получения концентрации 10 мг/мл.

Для приготовления силикагеля 220 г силикагеля КСК, размо­лотого на шаровой мельнице, залить 2 л дистиллированной воды, тщательно размешать и оставить для осаждения на 40 мин. За­тем надосадочную жидкость слить в другой стакан и довести водой объем до 2 л. Осадок, накопившийся в течение 2 ч, пере­мешать в минимальном количестве воды и оставить на ночь. Перед использованием к осадку добавить равное по объему ко­личество воды для приготовления рабочей суспензии. При ис­пользовании силикагеля Н 1,5 г носителя размешивают в 5 мл раствора безводного карбоната натрия (6,8 мг на 100 мл воды).

Для анализа фосфолипидов используют стеклянные пластин­ки размером 6x6 (9x12) см с закрепленным слоем силикагеля. Для этого к 25 мл 50 %-ной суспензии силикагеля добавить 80 мг просеянного и активированного гипса. 1 мл тщательно переме­шанной смеси нанести на предварительно обезжиренную стек­лянную пластинку и оставить влажную пластинку для высыха­ния на горизонтальной поверхности. Пластинки можно хранить в эксикаторе над безводным хлористым кальцием.

Раствор 100 мкг липидной фракции в 10 мкл хлороформа нанести микрошприцем в угол пластинки на расстоянии 1 см от края. Предварительно хроматографическая камера дожна быть насыщена парами растворителей в течение 20—30 мин. Хрома­тографию проводят сначала в вертикальном направлении в сис­теме 1 (хлороформ—метанол—25 %-ный водный раствор аммиа­ка в соотношении 13:7:1) до момента достижения верхнего края пластинки фронтом растворителей. После извлечения из каме­ры и просушивания пластинку поместить в другую камеру с си­стемой 2 (хлороформ—ацетон—метанол—ледяная уксусная кис­лота—вода в соотношении 10:4:2:2:1) и хроматографировать ли­пиды в перпендикулярном направлении. Затем необходимо вы­сушить пластинку, опрыснуть 10 % -ной серной кислотой в мета­ноле и проявить в течение 20 мин при 180 °С.

Рис. 62. Расположение индиви­дуальных фосфолипидов после про­ведения двумерной хроматографии в тонком слое силикагеля (Н. Ю. Каль- нова, 1992): 1 — лизофосфатидилхо- лин; 2 — сфингомиелин; 3 — фосфа­тидилхолин; 4 — фосфатидилэтанол­амин; 5 — фосфатидилсерин

деляют с помощью нингидрина. Для этого высушенные хрома­тограммы опрыскивают раствором нингидрина (0,3 моль/л) в бутаноле; после высушивания и нагревания пятна, соответствую­щие этим липидам, окрашиваются в розовый цвет. Для обнару­жения холинсодержащих фосфолипидов пластинки опрыскива­ют раствором Драгендорфа. При этом пятна, содержащие фос­фатидилхолин, сфингомиелин и лизофосфатидилхолин, окраши­ваются в ярко-розовый цвет.

Содержание фосфолипидов определяют по уровню неоргани­ческого фосфата по калибровочной прямой, полученной при по­мощи однозамещенного фосфорнокислого калия согласно мето­дике, описанной в лабораторной работе № 8. Предварительно после высушивания на воздухе пластинок их проявляют в парах йода. Затем пятна быстро и аккуратно “обкалывают” иголкой, потом снимают специальной лопаточкой и переносят в пробирки. В каж­дую пробирку добавляют 0,1 мл 42 %-ной хлорной кислоты, на­гревают при высокой температуре до обесцвечивания силикаге­ля и испарения кислоты. После охлаждения добавляют 0,49 мл хлорной кислоты, 0,81 мл воды, 0,4 мл 1,25 %-ного раствора молибдата аммония и 0,4 мл 5 %-ной аскорбиновой кислоты, выдерживают в кипящей водяной бане в течение 5 мин и фото- метрируют.

6.7.