ИССЛЕДОВАНИЕ УСТОЙЧИВОСТИ ЭРИТРОЦИТАРНЫХ МЕМБРАН К ДЕЙСТВИЮ ' РАЗЛИЧНЫХ ХИМИЧЕСКИХ АГЕНТОВ ПРИ ПОМОЩИ МЕТОДА РЕГИСТРАЦИИ ОСМОТИЧЕСКИХ И КИСЛОТНЫХ ЭРИТРОГРАММ[5]

Осмотическая резистентность клеточных популяций крови является важным показателем, характеризующим проницаезиость эритроцитарных мембран, белок-липидные взаимодействия в мем­бране, состояние белковых структур цитоскелета клетки.

Гемолиз эритроцитов под действием гемолитиков осупцеств- ляется через ряд последовательных стадий: пре дгемолитиче скую, стадию осмотического и химического гемоглобинолиза, строма- топороза и строматолиза. Главными показателями предгезмоли- тической стадии являются выход ионов калия в окружающую среду и сферуляция эритроцитов. Протекание гемоглобинолиза зависит от физико-химических свойств гемолитика. Так, при ос­мотическом гемоглобинолизе набухание эритроцитов до крити­ческого уровня приводит к повреждению мембраны, в результа­те чего свободная фракция внутриклеточного гемоглобина диф­фундирует наружу. Осмотический тип гемолиза не сопровожда­ется химическими изменениями состава эритроцитов, сохраня­ются также и его электрические свойства. Так как осмотичес­кий гемвлиз вызывает только частичный выход гемоглобина, то из этого следует, что часть гемоглобина находится в связанной со

стромой форме в виде гемолипостроматинового комплекса (со­единение гемоглобина с липидами и холестерином). Реализация процесса освобождения связанной фракции происходит в стадии химического гемоглобинолиза, осуществляющейся под действи­ем поверхностно-активных веществ (сапонин, дигитонин и др.). При этом наблюдается выход связанного гемоглобина вследствие распада гемолипостроматинового комплекса.

Все вышеперечисленные стадии протекают без нарушения морфологической целостности эритроцита. Стадия строматопо- роза, характеризующаяся проводимостью эритроцитами элект­рического тока при сохранении морфологической целостности клетки, наступает при действии на эритроциты концентрирован­ных растворов сапонина.

Полная дезинтеграция структуры клетки (строматолиз) про­исходит под влиянием холево-, дезоксихолево- и олеиновокис­лого натрия.

Принцип метода регистрации осмотических и кислотных эрит­рограмм заключается в фотометрической регистрации кинети­ки распада эритроцитов под действием гемолитика в определен­ной дозе. Мерой стойкости эритроцитов является время, в тече­ние которого происходит их разрушение. Многостадийный про­цесс вовлечения эритроцитов в гемолиз позволяет построить эрит­рограмму — зависимость их распределения по стойкости во вре­мени.

Лабораторная работа № 13

Автоматический метод регистрации осмотических и кислотных эритрограмм

Установка для регистрации эритрограмм, разработанная С. Г. Резваном на кафедре биофизики и биотехнологии Воронеж­ского государственного университета, позволяет измерять степень повреждения мембран эритроцитов по действием различных хи­мических агентов. Оптический блок установки состоит из фото­электрического колориметра ФЭК-56 М со встроенным диффе­ренциальным усилителем. Регистрационный блок представлен двухкоординатным регистратором ЛКД 4-003, цифровым вольт­метром В7-20. Для термостатирования суспензии эритроцитов применяют ультратермостат UTU-6 и термостатируемые кюве­ты. Электрическая схема предварительного усилителя позволя­ет получить линейную зависимость между истинным коэффи-

циентом светопропускания (Т) и выходным сигналом уста­новки.

Гемолиз эритроцитов проводят в кюветах с наружными раз­мерами 20x40x10 мм и рабочим объемом 4 мл. Точность хода луча ФЭКа составляет 0,01 мм. Для увеличения точности хода лучей ограничивают диаметр центрального окна кюветы до 0,8 см. Чувствительность ФЭКа при этом уменьшается, но результаты становятся более стабильными за счет уменьшения вклада свето­рассеяния. Измерение светопропускания проводят при длине волны 490 нм, так как в данном случае коэффициент молярной экстинкции оксигемоглобина минимален. Следовательно, при ис­пользовании этого метода регистрации тестируется не сам гемо­лиз (выход гемоглобина в среду инкубирования), а повреждение мембран эритроцитов: светорассеяние исследуемых образцов из­меняется за счет разрушения мембраны, в том числе ее цитоске­лета.

При проведении гемолиза эритроцитов в одной кювете уста­новка регистрирует S-образную интегральную кривую, форма ко­торой отражает суммарное изменение величины светорассеяния (т) в исследуемом растворе во времени, т. е. т - f(t) — рис. 61. В процессе гемолиза скорость распада эритроцитов достигает мак­симального значения примерно в середине кривой. При диффе­ренцировании сигнала интегральной кривой, т.е. зависимости dT/dt, в области максимальной скорости гемолиза эритроцитов

Рис. 61. Интегральная кри­вая осмотического (кислотного) гемолиза эритроцитов: 1 — фаза сферуляции; 2 — максимальная скорость гемолиза (v_mlx); 3 — вре­мя 50 % гемолиза (ї₅₀); 4 — ко­нечная фаза гемолиза. По оси аб­сцисс — время гемолиза; по оси ординат — степень гемолиза эритроцитов

появляется глобальный максимум. Кинетический метод регист­рации процесса разрушения эритроцитов позволяет оценивать следующие параметры:

t_mj, - время латентного периода гемолиза, с; t_n - собственное время гемолиза; t_Sfl - время половинного гемолиза, с;

^Vmax ^_ максимальная скорость гемолиза, отн. ед.;

G_sJ, G - степень сферуляции и гемолиза эритроцитов, %. Латентный период (t^) отражает время, прошедшее с момен­

та введения гемолитика в кювету до первого появления гемогло­бина вне эритроцита (участок “0—Г’на рис. 61). Смещение ин­тегральной кривой вниз от нулевой линии вызвано повышением интенсивности рассеяния света суспензией эритроцитов в резуль­тате их сферуляции. Истинный гемолиз, отраженный в виде S-кривой, представляет собой процесс последовательного вовле­чения всей массы эритроцитов (участок “1—4”); в первое время происходит разрушение самых старых эритроцитов, являющих­ся наименее стойкими (участок “1—2”).

Линейный участок S-образной кривой отражает кинетику рас­пада основной массы эритроцитов. Но и в этой фракции есть группа клеток, гемолиз которых происходит со скоростью, пре­вышающей скорость распада любой другой группы данной по­пуляции эритроцитов. Точка “2”, расположенная примерно в се­редине кривой, соответствует времени распада эритроцитов, про­исходящего с максимальной скоростью (v_max). Она соответствует положению максимума дифференциальной кривой.

Промежуток времени до начала разрушения самых нестой­ких клеток (точка “1”) до конца процесса (точка “4”) представ­ляет собственное время гемолиза. Время, прошедшее с момента введения гемолитика в кювету до выхода кривой на плато, — общее время гемолиза. Иногда удобнее пользоваться временем половинного гемолиза t₆₀ (точка “3”). Это время, за которое про­исходит распад 50 % эритроцитов. При исследовании кинетики гемолиза эритроцитов, индуцированного действием химических агентов, используются гипоосмотические растворы этих соедине­ний с различной концентрацией в 0,55 % NaCl.

6.6.