Молекулярный анализ микрорастений ежевики и малины с помощью RAPD-метода после длительного низкотемпературного хранения in vitro
Как было показано в предыдущих разделах работы, через 12 месяцев in vitro хранения уровень АФК (пероксида водорода) у микрорастений значительно возрастает, а активность пероксидаз и содержание аскорбиновой кислоты снижается.
Например, у микрорастений сорта ежевики Whitford Thomless к 12 месяцу уровень пероксида водорода составил 3,8 мкмоль/г сырой массы, увеличившись почти в 4 раза по сравнению с исходным. Возрастание уровня пероксиздаз указывает на стрессовый характер условий длительного низкотемпературного хранения, что может служить причиной мутационных изменений у сохраняемых растений. Для изучения соответствия микрорастений до закладки на низкотемпературное хранение и после 12 месяцев хранения при +4θC мы использовали /?/1РР-анализ с отобранными нами 24 случайными праймерами. Кроме того, те же праймеры были использованы для сравнения микрорастений и исходных растений полевой коллекции.Результаты исследований не выявили различий между исходными полевыми растениями и in vitro растениями после 12 месяцев низкотемпературного хранения ни по одному из 24-х использованных праймеров (рис. 16, 17). Эти результаты были одинаковыми для всех исследованных сортов.
Результаты исследований показали, что RAPD-спектры пробирочных растений всех изученных сортов малины и ежевики, сохраняемые 12 месяцев при пониженной температуре, не отличались от RAPD-спектров микрорастений одноименных сортов до закладки на хранение (рис. 17, 18).
Рис. 16. RAPD-спектры исходных растений сортов малины: Ранняя Сладкая (PC) (1, 2; 5, 6; 9, 10; 13, 14), Красноплодный Сеянец (КС) (3, 4; 7, 8; 11, 12; 15, 16) и микрорастений после низкотемпературного хранения in vitro (нечетные и четные номера дорожек, соответственно). Праймеры: 0pr2, 0pq9, 370.09 и 280.02.
M - маркер молекулярной массы.Как было отмечено выше, образование RAPD-фрагментов обусловлено связыванием праймера с независимыми участками ДНК в разных анонимных локусах. Поэтому применение значительного числа RAPD праймеров позволяет говорить о сканировании существенной части геномов сравниваемых образцов. В нашем исследовании при проведении ПЦР с 24-мя отобранными праймерами у изученных растений суммарно было выявлено 152 амплификационных фрагмента. Отсутствие различий в спектрах ампликонов исходных растений и микрорастений после 12 месяцев низкотемпературного хранения in vitro, позволяет говорить о сохранении ими генетической стабильности при повышении уровня АФК.
Рис. 17. Продукты амплификации ДНК микрорастений сортов малины (Ранняя Сладкая - PC5 Красноплодный Сеянец - KP) и ежевики (Whitford Thomless - WhT, Merton Thomless - МТ) с RAPD-праймерами: Opal2 (1-4), OpalO (5-10), Opr2 (11- 14), 270.01 (15-16), 280.02 (17-20), 370.09 (21-22), Opel4 (23-24). M - маркер молекулярной массы. Электрофорез в 10 % неденатурирующем ПААТ.
f - полевые растения; invl- исходные микрорастения до закладки на хранение; inv2 - микрорастения после низкотемпературного хранения in vitro.
Таким образом, через 12 месяцев хранения in vitro большая часть микрорастений (не зависимо от вида и сорта) остается жизнеспособной, a RAPD- спектры изученных микрорастений не отличаются от спектров исходных растений.
Можно полагать, что хранение пробирочных растений до одного года при низких положительных температурах обеспечивает надежное сохранение сортов малины, ежевики и земляники в контролируемых условиях среды in vitro.
Рис. 18. Электрофореграмма спектров продуктов амплификации ДНК микрорастений ежевики, полученных на основе RAPD-метода с использованием праймеров: Opr2, Opq9, 270.01 и 280.02 в вариантах - до закладки на низкотемпературное хранение и после 12 месяцев хранения in vitro.
Сорта: WhT - Whitford Thomless, MT - Merton Thornless, BB - Bodega Вау,
А - Агавам, M - маркер молекулярной массы.
Полученные данные указывают на надежность методологии низкотемпературного сохранения пробирочных растений. Данный срок (12 месяцев) можно рекомендовать для депонирования in vitro коллекций малины, ежевики, земляники при низких положительных температурах.
Использование ДНК маркеров следует рассматривать как один из подходов к изучению генетической стабильности сохраняемых в условиях in vitro образцов. Однако окончательный вывод о генетической стабильности и подлинности образцов, длительно сохраняемых в условиях in vitro, можно сделать после высадки материала в поле и проведении сравнительной оценки этих образцов с их полевыми аналогами по комплексу морфологических и агрономических признаков.