RAPD анализ растений малины и ежевики

Материал исследования включал сорта ежевики (Whitford Thornless, Merton Thomless, Silvan, Bodega Вау, Агавам) и малины (Mandarin, Canby, Rubin Bulgarski, Ранняя Сладкая, Красноплодный Сеянец).

Таким обраом, в изучение вошли 3 варианта проб ДНК, выделенных из: (1) листьев индивидуальных полевых растений, (2) микрорастений перед закладкой на хранение in vitro и (3) микрорастений после 12 месяцев низкотемпературного хранения in vitro. Следует отметить, что в варианте «микрорастения после 12 месяцев хранения» в жидком азоте одновременно фиксировали листья одних и тех же пробирочных растений ежевики и для экстракции ДНК и для оценки биохимических показателей.

Для выделения ДНК использовали модифицированный нами метод Дорохова и Клоке (1997). Растительную ткань (1-3 г листьев полевых растений, или 0,1-0,3 г листьев растений in vitro} растирали в жидком азоте и переносили в пробирки с экстракционным буфером (200 мМ трис-НС1, pH 7,5; 250 мМ NaCl; 25 мМ ЭДТА, 0,5 % SDS, 1% поливинилпирролидон - PVP), соотношение буфера к массе материала составляло 2:1. Экстракцию проводили при 65^oC в течение 30 минут. К образовавшемуся раствору ДНК добавляли половину объема 5М ацетата калия, пробирки несколько раз инвертировали и замораживали при -20^oC в течение 2 часов.

При наличии в препарате полифенольных соединений раствор обрабатывали поливинилполипирролидоном (PVPP, Sigma) до исчезновения желтой окраски (это, в основном, было необходимо при выделении ДНК из листьев полевых растений). Затем добавляли 5 M NaCl до конечной концентрации 0,5 M и затем, СТАВ (цетилтриметилбромид аммония) до конечной концентрации 0,4%. Выпавший осадок ДЫК собирали центрифугированием, промывали в 80% этаноле и окончательно растворяли в буфере ТЕ.

Чистоту выделенных проб ДНК контролировали спектрофотометрическим методом. При наличии в препарате полифенольных соединений раствор обрабатывали поливинилполипирролидоном до исчезновения желтой окраски. A₂₆₀∕A₂80 У B^cex полученных препаратов превышало значение 1,8.

Реакцию ПЦР проводили в 20 мкл реакционной смеси, содержащей 100 нг ДНК, 1 единицу Taq-полимеразы (фирма Dialat), однократный реакционный буфер (16 мМ (NH₄)₂SO₄; 67 мМ Трис-НС1; 0,01% Твин-20, pH 8,8), 2,5 мМ MgCl₂; 0,2 мМ каждого из дезоксинуклеотидов, 15 пкМ праймера.

При проведении ПЦР использовали следующие программы:

1) 94^oC в течение 3,30 мин, затем 37 циклов (94^oC - 0,45 мин, 29^oC - 2 мин, 72⁰C - 1,30 мин) и в заключение 72^oC - 10 мин.

2) 95^oC в течение 4 мин, затем 45 циклов (93⁰C - 0,45 мин, 37,5^oC - 0,45 мин, 72^oC - 1,30 мин) и в заключение 72^oC - 10 мин.

Всего для амплификации использовали 40 RAPD-праймеров, список которых приведен в таблице 1.

Полученные ПЦР продукты разделяли электрофорезом в горизонтальных агарозных гелях в буфере TBE (0,089 M трис; 0,089 M H₃BO₃; 0,002 M ЭДТА, pH буфера = 8,2), напряжение составляло 5 V на сантиметр длины геля. После электрофореза агарозные гели окрашивали бромистым этидием и визуализировали фрагменты в проходящем УФ-свете. Для контроля качества препаратов ДНК использовали электрофорез в 0,8% агарозных гелях также с последующей окраской бромистым этидием. Контролем служила ДНК фага λ.

В ряде случаев электрофорез проводили в 10%-ном полиакриламидном геле (ПААТ) в неденатурирующих условиях с последующей окраской нитратом серебра.

Таблица I. Список RAPD-праймеров, использованных для амплификации

2.3.