Молекулярный анализ микрорастенийежевики и малины с помощью RAPD-метода после длительного низкотемпературного хранения in vitro
Одним из критериев надежности тех или иных методик длительного хранения in vitro является генетическая идентичность сохраняемых микрорастений исходным растениям полевой коллекции.
Как известно, одной из проблем, возникающих при культивировании растений in vitro, является сомаклональная изменчивость, возникающая в культуре клеток и тканей. В то же время считается, что при использовании метода микроразмножения растений пазушными почками и сохранении образцов в условиях in vitro в виде микропобегов удается избежать появления сомаклональных вариантов (см. обзор литературы). Тем не менее, одной из актуальных проблем генбанков при организации хранения in vitro является проверка подлинности и сортовой чистоты образцов, а также разработка методов мониторинга генетической стабильности сохраняемых микрорастений. Применение ДНК маркеров может достаточно быстро предоставить информацию о подлинности образцов in vitro коллекции и о генетической стабильности исследуемых локусов. В последнее время для решения подобных задач наиболее часто используются ДНК маркеры на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР).RAPD-метод (Random Amplified Polymorphic DNA) представляет собой вариант ПЦР с использованием одного короткого (десяти- или четырнадцатичленного) праймера с произвольной последовательностью. Амплификационные фрагменты образуются между двумя сайтами связывания праймера. Различия между наборами амплификационных фрагментов двух образцов (выявляемые при помощи электрофореза) могут быть обусловлены как изменениями в местах связывания праймера, так и изменениями в последовательности ДНК между сайтами, например, в результате перестроек хромосом. Малые размеры случайного праймера увеличивают вероятность нахождения в обеих цепях ДНК нескольких комплементарных ему участков. Поэтому RAPD-праймеры часто инициируют амплификацию целого ряда дискретных локусов генома, что делает RAPD-анализ особенно удобным для контроля генетической стабильности образцов. Другим преимуществом RAPD-маркеров перед другими ДНК- маркерами является быстрота и экономичность процедуры.
Мы использовали RAPD- метод для молекулярно-генетического анализа микрорастений ежевики и малины после длительного низкотемпературного хранения in vitro и для выявления возможных сомаклонов.
В изучение вошли 3 варианта проб ДНК, выделенных из: (1) листьев полевых растений, (2) микрорастений перед закладкой на хранение in vitro и (3) после 12 месяцев низкотемпературного хранения in vitro.