Глава 4. Обсуждение результатов

Нарушения сигнального пути TGFβ принято считать ключевыми молеку- лярными механизмами развития фиброза при склеродермии [Сotton et al.,1998]. Данный фактор роста - главный профибротический цитокин, участвующий в аномальном отложении коллагена I и III типов, а также регулирующий множе- ственные клеточные функции, включая дифференцировку, пролиферацию, ми- грацию клеток, ангиогенез и прогрессию клеточного цикла [Zavadi et al., 2005; Ferrari et al., 2005].

дуляции регуляторов клеточного цикла, таких как циклин D1 и циклин E [Shaulian et al., 2001]. Данный факт позволяет предположить, что данная группа транскрипционных факторов представляет одно из важных звеньев патогенеза очаговой склеродермии. Для подтверждения данной гипотезы нами был иссле- дован уровень экспрессии генов в очагах бляшечной склеродермии. Ее досто- верное изменение позволило бы рассматривать данные гены в качестве канди- датов в развитии склеродермического процесса. Полученные с помощью мето- да ПЦР в реальном времени результаты свидетельствуют об увеличении экс- прессии практически всех генов АР-1 системы в пораженной склеродермией коже, за исключением гена FRA-1 (табл.23).

Таблица 23 Особенности экспрессии генов AP-1 в очагах поражения у больных склеродермией

Повышенная экспрессия генов компонентов АР-1 системы в пораженной склеродермией коже может быть обусловлена их участием в TGF-β1 сигнальном каскаде, индуцирующем экспрессию гена коллагена 1 типа. За последние годы большой прогресс был достигнут в изучении экспрессии данного гена и ее регуляции в ответ на воздействие различных цитокинов и факторов роста. Известно, что участок гена, расположенный между 265 и 241 парами нуклеотидов, связывающий транскрипционный фактор AP-1 и отвечающий за высокую базальную промотерную активность, играет ключевую роль в эффекте TGFβ. Мутация в данном участке приводит к практически полной потере ответа на воздействие трансформирующего фактора роста [Сhung et al., 1995].

В частности ранее было установлено, что фибробласты, нокаутные по гену JUN-D, оказывались мало чувствительны к TGF-β стимуляции и продуцировали значительно меньше коллагена [Palumbo et al., 2011]. Известно, что экспрессия гена JunD усиливается под воздействием TGF-β1, одновременно с этим обнаруживается маркер активности TGF-β1 - фосфорилированный белок Smad3, кроме того в фибробластах с дефицитом JunD отмечается резкое снижение экспрессии таргетных генов TGF-β1 [Gabrieli et al., 2009, Alanore et al.

Исходя из молекулярно-биологических принципов синтеза коллагена I типа TGF-β является активатором экспрессии гена JunB в фибробластах [Mauviel et al., 1993]. TGF-β индуцирует пролонгированное повышение экспрессии JunB минимум на 24 часа [Gervasi et al., 2012]. Транскрипционный фактор JunB ингибирует транс-активацию гена коллагеназы и предотвращает ее активацию другими факторами системы AP-1, в частности C-Jun. Известно, что TGF-β усиливает экспрессию гена jun-B в мезенхимальных клетках [Chung et al., 1996].Данный ген в свою очередь является немедленным ранним таргетным геном в сигнальном пути TGF-β-Smad. Совместно с транскрипционным фактором ATF-3, экспрессия которого также анализировалась в данном и с с л е д о в а н и и , J u n - B у ч а с т ву е т в р е п р е с с и и б е л к а и н г и б и т о р а дифференцировки-2 (Id-2), антагониста TGF-β индуцированной эпителиально- мезенхимальной транзиции. Данный процесс вносит важный вклад в

формирование миофибробластов и подобных им клеток, регулирующих отложение белков внеклеточного матрикса, таких как коллаген и фибронектин. При этом нокаутирование клеток по гену JunB приводило к блокировке разрыва межклеточных связей, синтезу профибротических белков и формированию клеточно-матриксных связей. JunB регулирует формирование данных связей, способствуя индукции синтеза интегрина β3 и актин-стабилизирующего белка тропомиозина.

Гены с-Jun и с-Fos представляют собой два основных компонента системы

AP-1 и характеризуются спо собно стью формировать гетеродимер,

взаимодействующий с ДНК и изменяющий транскрипционную активность. Ген с-Jun является потенциальным активатором промотера гена коллагеназы. Повышенная экспрессия данного гена оказывает блокирующее действие на TGF-β и снижает базовую активность промотера гена коллагена I до 60%. Увеличение экспрессии c-Jun возникает в ответ на повышение синтеза коллагена и необходима для его регуляции. по своей функции данный ген является антагонистом Jun-B и изменения в его экспрессии могут развиваться рефлекторно в ответ на изменения экспрессии Jun-B [Сhung et al., 1995].

В исследовании у пациентов с системным склерозом отмечалось повышение экспрессии генов c-Jun и с-Fos в фибробластах, выделенных из очагов поражения, причем прерывание аутокринной стимуляции TGF-β с помощью нейтрализующих антител приводило к резкому снижению уровня мРНК данных генов. Более того при стимуляции здоровых фибробластов фактором TGF-β приводило к зависимой от времени повышенной экспрессии c- Jun и c-Fos на уровне м-РНК и белковом уровне и, таким образом, повышенной транскрипционной активности AP-1 системы. При воздействии на фибробласты, выделенные у больных системным склерозом, селективным ингибитором системы AP-1 T-5524, ранее продемонстрировавшим эффективность in-vitro в разрешении коллаген-II индуцированного артрита у DBA/1J-мутантных мышей, значительно снижал индукцию мРНК коллагена I и II типов, фибронектина. Селективное ингибирование димера с-Jun/c-Fos за счет воздействия T-5524 снижала активацию фибробластов и синтез коллагена, как in vitro, так и в живых моделях. Таким образом воздействие ингибитора T-5224 прерывало профибротические эффекты TGF-β на синтез коллагена и дифференцировку фибробластов в миофибробласты через системуAP-1 [Avouac et al., 2012].

В данном исследовании в очагах поражения отмечалось достоверное увеличение экспрессии данного гена, причем среднее значение изменения экспрессии было ниже, чем для гена Jun-B (3,6 против 4). Это обстоятельство требует дальнейшего подтверждения на большей группе испытуемых, однако

можно предположить, что увеличение синтеза транскрипционного фактора С- Jun возникает регуляторно в ответ на повышенный патологический синтез коллагена, в свою очередь более низкие показатели экспрессии гена могут быть признаком недостаточности компенсаторных возможностей в пределах очага у пациентов со склеродермией. В то же время, учитывая данные, полученные Avouac et al. в исследованиях на фибробластах, выделенных у пациентов с системным склерозом, экспрессию данного гена следует рассматривать в совокупности с экспрессией гена c-Fos, поскольку данные транскрипционные факторы оказывают воздействие на транскрипцию ДНК путем взаимодействия с участками в виде гетеродимеров, а нокаутирование клеток по обоим генам приводила к резкому снижению базального синтеза коллагена как в патологических, так и в здоровых фибробластах.

В исследованиях у пациентов с системным склерозом опытным путем было подтверждено, что повышение экспрессии гена Fra-2 играет ключевую роль в гиперпродукции коллагена. Фибробласты, выделенные у пациентов с системным склерозом, нокаутированные по данному гену демонстрируют снижение синтеза коллагена на базовом уровне и на фоне стимуляции. Важную функцию в повышении экспрессии гена Fra-2 играет киназа ERK, ключевой компонент сигнального пути TGF-β, ингибирование которой блокирует стимулирующее действие фактора роста на транскрипцию гена Fra-2 [Reich et al., 2009]. Предполагается, что данный ген играет ключевую роль в развитии фибротических заболеваний. У мышей, трансгенных по Fra-2 отмечалось формирование фиброза легочной ткани, в то время как нокаутирование данного гена приводило к резкому снижению базального уровня экспрессии генов коллагена, а также индукции синтеза коллагена в ответ на стимуляцию профибротическими цитокинами. Тем не менее в сыворотки крови трансгенных мышей отсутствовали антитела к топоизомеразе I и эндотелию сосудов [Eferl et al., 2008]. В нашем исследовании уровень экспрессии гена Fra-2 в пораженных участках превышал уровень экспрессии в непораженной коже в среднем в 3.4 раза, при этом отсутствовала достоверная зависимость максимальных уровней

экспрессии от формы течения заболевания. Данные изменения могут быть связаны с эффектами сигнального пути TGF-β и, вероятно, свидетельствуют об участии гена Fra-2 в формировании фиброза. Кроме того FRA-2 может вносить вкад в формирование сосудистой патологии в склеродермических очагах. В исследованиях на мышах было продемонстрировано, что трансгенное усиление экспрессии Fra-2 у мышей приводит к пролиферации гладкомышечных клеток легочных со судов с формированием гистологиче ских изменений, напоминающих таковые у человека при легочной артериальной гипертензии, а также к прогрессирующей микроангиопатии с уменьшением числа капилляров. Кроме того доказано увеличение экспрессии данного гена в сосудах пациентов с системным склерозом [Verecchia et al., 2007; Eferl et al., 2008].

В ПЦР РВ биоптатов кожи у всех пациентов отмечались стойко отрицательные результаты экспрессии гена FRA-1. В исследованиях на мышах ранее было продемонстрировано, что FRA-1 дефицитных мышей отмечалось развитие тяжелого фиброза легочной ткани, в связи с чем предполагается, что данный ген отвечает за отрицательную регуляцию формирования фиброза. На ранних стадиях после воздействия блеомицином у таких мышей отмечалось более выраженное раннее нейтрофильное воспаление, а на поздних стадиях наблюда лись более тяжелые и прогре ссивные интерстициа льные фиброзирующие изменения, чем у мышей с нормальным генотипом. Таким образом ген FRA-1 несет регулирующую функцию ограничения формирования фиброза. В исследованиях in vitro при воздействии на эпителиальные клетки, нокаутные по гену Fra-1, блеомицином и TGF-β1 отмечалась повышенная экспрессия гена коллагена Col1A [Rajasekaran et al., 2012].

Результаты, полученные в данном исследовании доказывают ключевую роль F R A - 1 в п ато ге н е з е ф и б р от и ч е с к и х и зм е н е н и й н е тол ь ко интерстициальных заболеваний легких, но и гиперпродукции коллагена в коже. Наибольшие показатели снижения экспрессии отмечались у пациентки с выраженным уплотнением очага, атрофией и фиброзными изменениями в бляшках, что вместе с общей тенденцией ингибирования данного гена системы

один может свидетельствовать о выраженных нарушениях в системе отрицательной регуляции отложения внеклеточного матрикса у пациентов. В исследованиях in-vitro c фибробластами легких установлено, что протективный эффект FRA-1 связан с регуляцией провоспалительных событий, экспрессией про-фибротических и фибротических генов и трансдифференциацией эпителиальных клеток и фибробластов [Megan et al., 2012]. Несмотря на доказанное участие различных эффекторных путей в формировании фибротических изменений кожи до сих пор не разработано их эффективного лечения. Таким образом таргетная активация Fra-1 может быть перспективным с точки зрения терапии склеродермии.

У пациентов с очаговой склеродермией также отмечалось увеличение экспрессии гена FosB в очагах в среднем в 3,5±1,7 раза. Ген Fos-B представляет собой компонент семейства транскрипционных факторов AP-1, участвующий в регуляции диффренцировки остеобластов и формировании кости [Haasper et al., 2008]. Повышенная экспрессия данного гена в пораженных склеродермией участках кожи может быть связана с участием данного гена в регуляции синтеза коллагена III типа. Как отмечалось выше, в основе склеродермического процесса лежит патологическое отложение коллагена I и III типа. В и с с л е д о в а н и я х , п р о в е д е н н ы х i n v i t r o S c h u e r m a n n e t a l . б ы л о продемонстрировано, что в фибробластах, трансформированных по гену fosB отмечалось повышение экспрессии генов, кодирующих синтез α цепей коллагена III типа. Также повышение экспрессии данного гена в очагах может свидетельствовать об активации апоптотического процесса в клетках, регулируемого TGF-β. Ранее было установлено, что подавление функции FosB приводило к значительному нарушению апоптоза, индуцированного TGF-β сигнальным путем. Во время данного процесса происходит индукция экспрессии генов JunD и FosB, их димер в свою очередь активирует транскрипцию таргетных генов, ответственных за апоптоз [Yamamura et al., 2001]. Активация данного гена, выявленная в бляшках у пациентов с очаговой

склеродермией, может свидетельствовать об активации апоптоза в клетках в пределах очага.

Результаты, полученные с помощью метода ПЦР в реальном времени, свидетельствуют об увеличении экспрессии генов ATF-1, ATF-3 и ATF-4 у всех пациентов в пораженной склеродермией коже. Патологическая активация экспрессии данных генов, как компонентов транскрипционного комплекса АР-1, может быть обусловлена их участием в TGF-β1 опосредованном пути развития фиброза и патологического воспаления. В частности в исследованиях на клетках карциномы молочной железы было продемонстрировано, что экспрессия гена ATF-3 повышается под действием TGF-β1. Данный транскрипционный фактор играет интегрирующую роль для TGF-β1, усиливая экспрессию его таргетных генов, кроме того ATF-3 усиливает экспрессию самого TGF-β1 по принципу положительной обратной связи для сигнального пути TGF-β1 [Yin et al., 2010]. ATF-3 усиливает экспрессию гена TGF-β1 напрямую а также через усиление экспрессии генов интегринов αv и β6 - двух генов, вовлеченных в активацию TGF-β1 [Jenkins et al., 2008]. Транскрипционный фактор ATF-3 индуцируется большим количеством стрессовых сигналов и может служить связующим звеном для различных сигналов, направляя их эффекты в сигнальный путь TGF-β1 [Yin et al., 2010]. Учитывая ключевую роль TGF-β1 в патогенезе склеродермического процесса повышенная экспрессия ATF-3 в очагах склеродермии у пациентов может свидетельствовать о важной роли данного фактора в регуляции функций TGF- β1.

Усиление экспрессии гена ATF-4 у пациентов с очаговой склеродермией было наибольшим, среднее значение изменения уровня экспрессии гена оказалось повышенным в 4,58±3 раза. Фактор ATF-4 усиливает экспрессию генов стресса эндоплазматического ретикулума [Harding et al., 2000]. Предполагается, что данный процесс способствует формированию фиброза в ткани за счет активации про-апоптотических патологических путей, индукции эпителиально-мезенхимальной транзиции и усилению воспалительного ответа

[Tanjore H et al., 2012]. Кроме того фактор ATF-4 принято считать одним из ключевых транскрипционных факторов, участвующих в клеточном ответе на оксидантный стресс, путем усиления биосинтеза глутатиона. Оксидантный стресс активирует PERK путь и фосфорилирование фактора активации трансляции eIF2α, что увеличивает экспрессию гена ATF-4 [Rutkowski et al., 2003]. В норме ATF-4 постоянно экспрессируется в клетках в небольших количествах, но в определенных условиях клеточного стресса происходит быстрая индукция гена. В фибробластах ATF-4 координирует ответ на аминокислотное истощение, оксидантный стресс и стресс эндоплазматического ретикулума и помогает сбалансировать окислительно-восстановительный гомеостаз. Было продемонстрировано, что фибробласты с дефицитом ATF-4 имели склонность к гибели на фоне искусственного оксидантного стресса и депривации аминокислот [Harding et al., 2003]. В пигментных клетках сетчатки A R P E - 1 9 / H V P - 1 6 п од в о зд е й с т в и е м о кс и д а н т н о го с т р е с с а б ы л о продемонстрировано усиление экспрессии гена фактора роста сосудистого эндотелия за счет ATF-4 механизмов, что может быть свидетельствовать об участии данного фактора в ангиогенезе [Roybal et al., 2004; Roybal et al., 2005]. Оксидантный стресс является одним из звеньев патогенеза склеродермии, в связи с чем высокие уровни экспрессии ATF-4 в патологических очагах могут свидетельствовать об адаптации ткани к условиям оксидантного стресса и косвенно подтверждать его роль в патогенезе заболевания. Учитывая, что при склеродермии развивается во спаление мелких со судов в пределах патологического очага, полученные данные позволяют предположить об участии ATF-4 в сосудистом поражении при склеродермии.

Таким образом, исходя из анализа литературных данных и полученных р е з ул ьт а т о в и с с л е д о в а н и я , г е н ы с и з м е н е н н о й э к с п р е с с и е й в склеродермических очагах можно классифицировать на категории, каждую из которых можно использовать в качестве терапевтической мишени в лечении заболевания (табл.24). Транскрипционные факторы JunD, FRA2, Jun-C и с-Fos (в форме димера) и соответствующие им гены можно отнести к напрямую

активирующим гиперпродукцию коллагена. Селективные ингибиторы данных т ранскрипционных факторов и соответ ствующих генов являют ся перспективными лекарственными препаратами при очаговой склеродермии.

Таблица 24 Факторы AP-1 как вероятные компоненты патогенеза и терапевтические мишени при очаговой склеродеримии

В то же время у большинства пациентов отчетливо наблюдалось стойкое снижение экспрессии гена FRA-1, в норме отрицательно регулирующего синтез коллагена. В связи с этим можно выделить еще одно патогенетическое звено - срыв обратной регуляции коллагенообразования. Протективный эффект FRA-1 может быть также связан с ролью данного транскрипционного фактора в регу- ляции провоспалительных механизмов и трансдифференциацировки эндотели- альных клеток и фибробластов. Активация сигнального пути FRA-1 является перспективной таргетной терапией для очаговой склеродермии и других фибро- зирующих заболеваний.

Факторы ATF-3 и JUN-B не влияют непосредственно на синтез коллагена, однако их функция важна в патогенезе очаговой склеродермии с точки зрения регуляции сигнального пути TGFβ. Совместно эти факторы составляют репрес- сивный комплекс, взаимодействующий с участками генов, связывающих AP-1 комплекс, и в первую очередь с геном ингибитора дифференцировки 2, антаго- ниста функций TGFβ. Кроме того, как отмечалось выше JUN-B - важный био- маркер фиброза, за счет участия в регуляции ремоделирования матрикса и фор- мирования межклеточных взаимодействий. Таким образом, воздействие на дан-

ный фактор также является одним из возможных подходов к комплексному ле- чению очаговой склеродермии. За счет положительной обратной стимуляции экспрессии гена TGFβ напрямую и через систему интегринов данный ATF-3 становится важной терапевтической целью для таргетного ингибирования, по- скольку ингибирование данного фактора может прерывать путь TGFβ до акти- вации AP-1 зависимых процессов, в первую очередь это касается гиперпродук- ции коллагена.

Среди всех генов системы AP-1 у гена ATF-4 отмечалось наибольшее уве- личение экспрессии. Данное изменение свидетельствует о высокой активности антиоксидантной системы, поскольку транскрипционный фактор ATF-4 являет- ся индуктором глутатиона и синтезируется в клетках в условиях оксидантного стресса. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о высоком на- пряжении антиоксидантной системы и, вероятно, важной роли оксидантного стресса в патогенезе склеродермии. Антиоксиданты остаются малоизученной категорией лекарственных препаратов, но тем не менее спектр заболеваний, при которых данная группа препаратов может быть эффективной постоянно расши- ряется. Одной из таких нозологий может стать очаговая склеродермия.

Исходя из полученных данных, воздействие на все выделенные выше тера- певтические мишени, вероятно, могло бы прервать патологический процесс и развитие склеродермии, однако важно учитывать тот факт, что межгенные вза- имодействия, а также тонкости сигнальных путей до сих пор остаются загадкой для ученых. Поэтому последствия полного перекрытия сигнальных путей не всегда может приводить к желаемым результатам. В частности в исследованиях, проведенных на животных моделях одновременное блокирование экспрессии генов JunB и c-Jun приводило к фенотипическим изменениям с гистологиче- скими и молекулярными признаками, соответствующими псориазу, включая развитие артрита. Селективное ингибирование JunB или c-Jun не приводило к указанным изменениям [Zenz et al., 2005]. Данные результаты свидетельствуют о необходимости детального исследования «выключения».